概要

大規模ヒト脳イメージングにおけるライトシート蛍光顕微鏡のための光学的透明化と標識

Published: January 26, 2024
doi:

概要

現在のプロトコルは(Sの魔女- H2O2 -抗原 Retrieval – 2,2′ -チオジエタノール[TDE])の薄板の蛍光顕微鏡検査のイメージ投射と短いティッシュの変形の技術を日常的に高いスループットのプロトコルのイメージ投射と結合することによって多数の死後の人間の頭脳セクションの急速で、同時光学清算、多円形の分類および3D容積測定の復元のための段階的なプロシージャを提供する。

Abstract

過去10年間に数多くの透明化技術が登場したにもかかわらず、死後の人間の脳の処理は、その寸法と複雑さのために依然として困難な作業であり、マイクロメートルの解像度でのイメージングを特に困難にしています。この論文では、ライトシート蛍光顕微鏡(LSFM)によるサンプルの透明化、ラベリング、およびシーケンシャルイメージングを可能にするSHORT (SWITCH – H2O2 – Antigen Retrieval – 2,2′-チオジエタノール[TDE])組織形質転換プロトコルで数十のセクションを同時に処理することにより、ヒト脳の体積部分の再構築を行うプロトコルを紹介します。SHORTは、複数のニューロンマーカーを含む厚いスライスの迅速な組織透明化と均質なマルチラベリングを提供し、白質と灰白質の両方で異なるニューロン亜集団の同定を可能にします。クリア後、スライスはLSFMを介してマイクロメートルの解像度で複数のチャンネルで同時にイメージングされ、迅速な3D再構成が可能です。ルーチンのハイスループットプロトコル内でSHORTとLSFM解析を組み合わせることにより、広い体積領域の3D細胞構造再構成を短時間で高解像度で取得することができ、ヒト脳の包括的な構造特性評価が可能になります。

Introduction

ヒトの脳の大量の3D分子組織と細胞構造を解析するには、検体の光学的透明性が必要であり、処理時間の長いプロトコルによって達成されます。組織内の屈折率(RI)の不均一性を最小限に抑えるために光学透明化技術が開発され、それによって光の散乱を低減し、高解像度イメージングのための光の浸透深さを増加させました1,2,3,4,5。透明化および深部組織標識法の現在の進歩により、最先端の顕微鏡技術を活用することにより、無傷のげっ歯類の臓器および胚の体積イメージングが可能になります6,7,8,9,10,11,12。

しかし、死後の人間の脳の広い領域の体積3D再構成は、モデル生物と比較して依然として困難な課題です。複雑な生物学的組成とさまざまな死後の固定および保存条件は、組織の透明化効率、抗体の浸透深さ、およびエピトープ認識を損なう可能性があります13141516171819。さらに、モデル生物と比較して、大きなヒトの脳領域の効率的な透明化と均一な標識を達成するためには、機械的組織切片とそれに続く各スライスの透明化と標識が依然として必要であり、その結果、処理時間が長くなり、高度なカスタム機器が必要になります15,20,21,22

SWITCH – H2O2 – 抗原 R賦活化 – TDE (SHORT) 組織形質転換技術は、ヒトの脳の大量の分析に特化して開発された18,23。この方法では、SWITCHプロトコル11の組織構造保存と高濃度の過酸化水素を使用して、エピトープ修復と組み合わせて組織の自家蛍光を減少させます。SHORTは、異なるニューロンサブタイプ、グリア細胞、血管系、および有髄線維のマーカーを用いて、ヒトの脳スライスを均一に染色することを可能にします18,24。その結果は、低密度および高密度タンパク質の両方の分析に適合します得られた高い透明性レベルと均一な標識により、蛍光顕微鏡法による厚切りの体積再構成が可能になり、特に、高速取得ライトシート装置1824252627を使用することができる。

この研究では、SHORT組織形質転換技術を使用して、ホルマリン固定された数十のヒト脳切片の同時透明化とマルチラウンドラベリングを行う方法について説明します。4つの異なる蛍光マーカーを併用することで、異なる細胞亜集団を同定することができます。クリアリング後、蛍光顕微鏡で高分解能の体積イメージングを行うことができます。ここでは、カスタムメイドの逆LSFM 18,24,25,26,27を使用し、サンプルの高速光学セクショニングと複数のチャンネルの並列取得を可能にしました。この日常的にハイスループットプロトコルにより、ブローカの領域全体のマッピングですでに実証されているように、人間の脳の広い領域の細胞内分解能で包括的な細胞および構造特性評価を得ることができます23

Protocol

ホルマリン固定ヒト組織サンプルは、マサチューセッツ総合病院(MGH)剖検サービス(米国ボストン)の神経病理学部門から提供されました。Partners Institutional Biosafety Committee(PIBC、プロトコル2003P001937)からIRBが承認した組織収集プロトコルに従って、死亡前に健康な参加者から書面による同意が得られました。承認文書は、米国マサチューセッツ州ボストンのMGH剖検サービスに保管されており、リ?…

Representative Results

ここで説明するプロトコルは、SHORT法を使用して、厚さ100μmから500μmの範囲の複数のスライスの同時処理を可能にします。このアプローチにより、手順全体の処理時間が大幅に短縮されます。この研究では、複数の死後ヒト脳厚切片を同時に処理するためのパイプライン全体(図1)を包括的に説明し、一度に24スライスのプロトコルを実証します(図2A…

Discussion

ヒトの脳の大きな領域の高解像度イメージングと3D再構成には、機械的組織切片作成とそれに続く光学的透明化と単一スライスの免疫標識が必要です。ここに示されるプロトコルは短いティッシュの変形方法がLSFMの細胞内決断の3D頭脳の再建のための多数の人間の頭脳の厚いセクションの急速で、同時処理に使用することができる方法を記述する。

他のアプローチとは異…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

マサチューセッツ総合病院、A.A. Martinos Center for Biomedical Imaging、放射線科のBruce Fischl氏に、この研究で分析されたヒト脳標本を提供していただいたことに感謝します。本プロジェクトは、欧州連合(EU)のホライズン2020研究・イノベーションフレームワークプログラム(Horizon 2020 Research and Innovation Framework Programme)から助成金契約第654148号(Laserlab-Europe)、欧州連合(EU)のHorizon 2020 Framework Programme for Research and Innovation(研究・イノベーションのためのホライズン2020フレームワークプログラム)から特定助成契約第785907号(Human Brain Project SGA2)および第945539号(Human Brain Project SGA3)から、米国国立衛生研究所総合病院コーポレーションセンター(National Institutes of Health)から助成金U01 MH117023で資金提供を受けました。 Euro-Bioimaging Italian Node(ESFRI研究インフラストラクチャ)の枠組みにおけるイタリア教育省から。最後に、この研究は「Fondazione CR Firenze」の協力を得て行われました。この作業の内容は著者の責任であり、必ずしも米国国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。 図 1 は BioRender.com で作成されました。

Materials

2,2'-thiodiethanol Merck Life Science S.R.L. 166782
Acetamide >= 99.0% (GC) Merck Life Science S.R.L. 160
Agarose High EEO Merck Life Science S.R.L. A9793
Boric Acid Merck Life Science S.R.L. B7901
Compressome VF-900-0Z Microtome Precisionary /
Coverslips LaserOptex / customized
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate Merck Life Science S.R.L. E5134
Glutaraldehyde Merck Life Science S.R.L. G7651
Glycine Santa Cruz Biotechnology SC_29096
Hydrogen Peroxide 30% Merck Life Science S.R.L.
Incubator ISS-4075 Lab companion  /
Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) / / custom-made
Loctite Attak Henkel Italia srl /
Microscope slides Laborchimica / customized
Phospate buffer saline tablet Merck Life Science S.R.L. P4417
Picodent Twinsil Picodent 13005002 out of production
Potassium Hydrogen Phtalate Merck Life Science S.R.L. P1088
Sodium Azide Merck Life Science S.R.L. S2002
Sodium Dodecyl Sulfate Merck Life Science S.R.L. L3771
Sodium Sulfite Merck Life Science S.R.L. S0505
Spacers Microlaser srl customized
Sputum Containers (dishes with screw lids) Paul Boettger GmbH & Co. KG 07.061.2000
Tris Base PanReac AppliChem (ITW reagents) A4577,0500
Triton X-100 Merck Life Science S.R.L. T8787
Tubes Sarstedt 62 547254
Tween 20 Merck Life Science S.R.L. P9416
Vibratome VT1000S Leica Biosystem /
Water bath  Memmert WNB 7-45
Antibodies and Dyes
Alexa Fluor 488 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson Immuno Reasearch 611-545-215 Dilution used, 1:200
Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L) Jackson Immuno Reasearch 805-545-180 Dilution used, 1:200
Alexa Fluor 647 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson Immuno Reasearch 611-605-215 Dilution used, 1:200
Anti-NeuN Antibody Merck Life Science S.R.L. ABN91 Dilution used, 1:100
Anti-Parvalbumin antibody (PV) Abcam ab32895 Dilution used, 1:200
Anti-Vimentin antibody [V9] – Cytoskeleton Marker (VIM) Abcam ab8069 Dilution used, 1:200
Calretinin Polyclonal antibody ProteinTech 12278_1_AP Dilution used, 1:200
DAPI ThermoFisher D3571 Dilution used, 1:100
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568) Abcam ab175700 Dilution used, 1:200
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) Abcam ab150107 Dilution used, 1:200
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568) Abcam ab175470 Dilution used, 1:200
Donkey Anti-Rat IgG H&L (Alexa Fluor 568) preadsorbed Abcam ab175475 Dilution used, 1:200
Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 488) Abcam ab150169 Dilution used, 1:500
Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 568) Abcam ab175711 Dilution used, 1:500
Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 647) Abcam ab150171 Dilution used, 1:500
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) Abcam ab150077 Dilution used, 1:200
Recombinant Alexa Fluor 488 Anti-GFAP antibody Abcam ab194324 Dilution used, 1:200
Somatostatin Antibody YC7 Santa Cruz Biotechnology sc-47706 Dilution used, 1:200
Vasoactive intestinal peptide (VIP) ProteinTech 16233-1-AP Dilution used, 1:200

参考文献

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記事を引用
Di Meo, D., Ramazzotti, J., Scardigli, M., Cheli, F., Pesce, L., Brady, N., Mazzamuto, G., Costantini, I., Pavone, F. S. Optical Clearing and Labeling for Light-sheet Fluorescence Microscopy in Large-scale Human Brain Imaging. J. Vis. Exp. (203), e65960, doi:10.3791/65960 (2024).

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