概要

ניקוי אופטי ותיוג עבור מיקרוסקופ פלואורסצנטי של יריעות אור בדימות מוח אנושי בקנה מידה גדול

Published: January 26, 2024
doi:

概要

הפרוטוקול הנוכחי מספק הליך שלב אחר שלב לניקוי אופטי מהיר ובו-זמני, תיוג מוטי עגול ושחזור נפחי תלת-ממדי של עשרות קטעי מוח אנושיים לאחר המוות על ידי שילוב (SWITCH – H 2O2 – Antigen Retrieval – 2,2′-thiodiethanol [TDE]) טכניקת טרנספורמציה קצרה של רקמות עם הדמיה במיקרוסקופ פלואורסצנטי של יריעות אור בפרוטוקול תפוקה גבוהה באופן שגרתי.

Abstract

למרות טכניקות הניקוי הרבות שהתפתחו בעשור האחרון, עיבוד מוחות אנושיים לאחר המוות נותר משימה מאתגרת בשל ממדיו ומורכבותו, המקשים במיוחד על הדמיה ברזולוציה מיקרומטרית. מאמר זה מציג פרוטוקול לביצוע שחזור חלקים נפחיים של המוח האנושי על ידי עיבוד סימולטני של עשרות מקטעים עם פרוטוקול טרנספורמציית רקמות קצר (SWITCH – H2O2 – Antigen Retrieval – 2,2′-thiodiethanol [TDE]), המאפשר ניקוי, תיוג והדמיה רציפה של הדגימות במיקרוסקופ פלואורסצנטי של גיליון אור (LSFM). SHORT מספק ניקוי רקמות מהיר ותיוג הומוגני של פרוסות עבות עם מספר סמנים עצביים, המאפשר זיהוי של תת-אוכלוסיות עצביות שונות הן בחומר הלבן והן בחומר האפור. לאחר הניקוי, הפרוסות מצולמות באמצעות LSFM ברזולוציה מיקרומטרית ובמספר ערוצים בו זמנית לשחזור תלת ממדי מהיר. על ידי שילוב של SHORT עם ניתוח LSFM בתוך פרוטוקול בעל תפוקה גבוהה באופן שגרתי, ניתן לקבל שחזור ציטוארכיטקטורה תלת ממדי של אזורים נפחיים גדולים ברזולוציה גבוהה בזמן קצר, ובכך לאפשר אפיון מבני מקיף של המוח האנושי.

Introduction

ניתוח הארגון המולקולרי התלת-ממדי והציטוארכיטקטורה של נפחים גדולים של המוח האנושי דורש שקיפות אופטית של דגימות, המושגת באמצעות פרוטוקולים בעלי זמן עיבוד נרחב. טכניקות ניקוי אופטי פותחו כדי למזער את ההטרוגניות באינדקס השבירה (RI) בתוך הרקמות, ובכך להפחית את פיזור האור ולהגדיל את עומק חדירת האור עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה 1,2,3,4,5. ההתקדמות הנוכחית בשיטות ניקוי ותיוג רקמות עמוק מאפשרות הדמיה נפחית של איברי מכרסמים ועוברים שלמים על ידי שימוש בטכניקות מיקרוסקופיה מתקדמות 6,7,8,9,10,11,12.

עם זאת, שחזור תלת-ממדי נפחי של אזורים גדולים במוח האנושי לאחר המוות עדיין מהווה משימה מאתגרת בהשוואה לאורגניזמים לדוגמה. ההרכב הביולוגי המורכב ותנאי הקיבוע והאחסון המשתנים לאחר המוות עלולים לפגוע ביעילות פינוי הרקמות, עומק חדירת הנוגדנים וזיהוי האפיטופ 13,14,15,16,17,18,19. יתר על כן, חיתוך רקמות מכני וניקוי ותיוג לאחר מכן של כל פרוסה עדיין נדרשים כדי להשיג ניקוי יעיל ותיוג אחיד של אזורי מוח אנושיים גדולים, וכתוצאה מכך זמני עיבוד ארוכים וצורך בציוד מותאם אישית מתוחכם, בהשוואה לאורגניזמים מודל 15,20,21,22.

SWITCH – H2O2 – antigen Retrieval –TDE (SHORT) TISSUE TRANSFORMATION TECHNIQUE פותחה במיוחד כדי לנתח נפחים גדולים של המוח האנושי18,23. שיטה זו משתמשת בשימור מבני הרקמה של פרוטוקול SWITCH11 ובריכוזים גבוהים של מי חמצן כדי להפחית את האוטופלואורסצנטיות של הרקמות, בשילוב עם שחזור אפיטופים. SHORT מאפשר צביעה אחידה של פרוסות מוח אנושיות עם סמנים עבור תת-סוגים עצביים שונים, תאי גלייה, כלי דם וסיבים myelinated18,24. תוצאותיו תואמות את הניתוח של חלבונים בצפיפות נמוכה וגבוהה. רמות השקיפות הגבוהות המתקבלות והתיוג האחיד מאפשרים שחזור נפחי של פרוסות עבות עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי, בפרט, לרכישה מהירה ניתן להשתמש במנגנון יריעות אור 18,24,25,26,27.

בעבודה זו, אנו מתארים כיצד ניתן להשתמש בטכניקת טרנספורמציית רקמות SHORT עבור ניקוי סימולטני ותיוג רב-עגול של עשרות חלקי מוח אנושיים קבועים בפורמלין. ניתן להשתמש בארבעה סמנים פלואורסצנטיים שונים יחד, מה שמוביל לזיהוי של תת-אוכלוסיות תאיות שונות. לאחר הניקוי, ניתן לבצע הדמיה נפחית ברזולוציה גבוהה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. כאן, השתמשנו ב- LSFM הפוך בהתאמה אישית 18,24,25,26,27, המאפשר חתך אופטי מהיר של הדגימה ורכישה מהירה של ערוצים מרובים במקביל. בעזרת פרוטוקול זה, בעל תפוקה גבוהה באופן שגרתי, ניתן לקבל אפיון תאי ומבני מקיף ברזולוציה תת-תאית של אזורים נרחבים במוח האנושי, כפי שכבר הוכח במיפוי של אזור ברוקה שלם23.

Protocol

דגימות רקמה אנושית מקובעת פורמלין סופקו על ידי המחלקה לנוירופתולוגיה בשירות הנתיחה שלאחר המוות של בית החולים הכללי של מסצ’וסטס (MGH) (בוסטון, ארה”ב). הסכמה בכתב התקבלה ממשתתפים בריאים לפני המוות, בהתאם לפרוטוקולי איסוף רקמות שאושרו על ידי IRB מהוועדה לבטיחות ביולוגית מוסדית של השותפים (PIBC, protoc…

Representative Results

הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר טיפול סימולטני במספר פרוסות, בעובי הנע בין 100 מיקרומטר ל-500 מיקרומטר, בשיטת SHORT. גישה זו מפחיתה באופן משמעותי את זמן העיבוד הכולל של ההליך כולו. בעבודה זו אנו מספקים תיאור מקיף של כל הצינור (איור 1) לעיבוד מקטעים עבים מרובים במוח האנושי לאחר המוות בו …

Discussion

הדמיה ברזולוציה גבוהה ושחזור תלת-ממדי של אזורי מוח אנושיים גדולים דורשים חתך רקמות מכני ואחריו ניקוי אופטי ותיוג חיסוני של פרוסות בודדות. הפרוטוקול המוצג כאן מתאר כיצד ניתן להשתמש בשיטת טרנספורמציית רקמות SHORT לעיבוד מהיר ובו-זמני של מקטעים עבים מרובים במוח האנושי לשחזור מוח תלת-ממדי ברזו…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים לברוס פישל, בית החולים הכללי של מסצ’וסטס, מרכז א.א. מרטינוס לדימות ביו-רפואי, המחלקה לרדיולוגיה, על אספקת דגימות המוח האנושי שנותחו במחקר זה. פרויקט זה קיבל מימון מתוכנית מסגרת המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי תחת הסכם מענק מס ‘654148 (Laserlab-Europe), מתוכנית המסגרת Horizon 2020 של האיחוד האירופי למחקר וחדשנות במסגרת הסכם המענק הספציפי מס ‘785907 (פרויקט המוח האנושי SGA2) ומס ‘945539 (פרויקט המוח האנושי SGA3), ממרכז תאגיד בית החולים הכללי של המכונים הלאומיים לבריאות תחת פרס מספר U01 MH117023, וממשרד החינוך האיטלקי במסגרת Euro-Bioimaging Italian Node (תשתית מחקר ESFRI). לבסוף, מחקר זה בוצע בתרומת “Fondazione CR Firenze”. התוכן של עבודה זו הוא באחריותם הבלעדית של המחברים ואינו מייצג בהכרח את הדעות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות. איור 1 נוצר באמצעות BioRender.com.

Materials

2,2'-thiodiethanol Merck Life Science S.R.L. 166782
Acetamide >= 99.0% (GC) Merck Life Science S.R.L. 160
Agarose High EEO Merck Life Science S.R.L. A9793
Boric Acid Merck Life Science S.R.L. B7901
Compressome VF-900-0Z Microtome Precisionary /
Coverslips LaserOptex / customized
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate Merck Life Science S.R.L. E5134
Glutaraldehyde Merck Life Science S.R.L. G7651
Glycine Santa Cruz Biotechnology SC_29096
Hydrogen Peroxide 30% Merck Life Science S.R.L.
Incubator ISS-4075 Lab companion  /
Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) / / custom-made
Loctite Attak Henkel Italia srl /
Microscope slides Laborchimica / customized
Phospate buffer saline tablet Merck Life Science S.R.L. P4417
Picodent Twinsil Picodent 13005002 out of production
Potassium Hydrogen Phtalate Merck Life Science S.R.L. P1088
Sodium Azide Merck Life Science S.R.L. S2002
Sodium Dodecyl Sulfate Merck Life Science S.R.L. L3771
Sodium Sulfite Merck Life Science S.R.L. S0505
Spacers Microlaser srl customized
Sputum Containers (dishes with screw lids) Paul Boettger GmbH & Co. KG 07.061.2000
Tris Base PanReac AppliChem (ITW reagents) A4577,0500
Triton X-100 Merck Life Science S.R.L. T8787
Tubes Sarstedt 62 547254
Tween 20 Merck Life Science S.R.L. P9416
Vibratome VT1000S Leica Biosystem /
Water bath  Memmert WNB 7-45
Antibodies and Dyes
Alexa Fluor 488 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson Immuno Reasearch 611-545-215 Dilution used, 1:200
Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L) Jackson Immuno Reasearch 805-545-180 Dilution used, 1:200
Alexa Fluor 647 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson Immuno Reasearch 611-605-215 Dilution used, 1:200
Anti-NeuN Antibody Merck Life Science S.R.L. ABN91 Dilution used, 1:100
Anti-Parvalbumin antibody (PV) Abcam ab32895 Dilution used, 1:200
Anti-Vimentin antibody [V9] – Cytoskeleton Marker (VIM) Abcam ab8069 Dilution used, 1:200
Calretinin Polyclonal antibody ProteinTech 12278_1_AP Dilution used, 1:200
DAPI ThermoFisher D3571 Dilution used, 1:100
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568) Abcam ab175700 Dilution used, 1:200
Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) Abcam ab150107 Dilution used, 1:200
Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568) Abcam ab175470 Dilution used, 1:200
Donkey Anti-Rat IgG H&L (Alexa Fluor 568) preadsorbed Abcam ab175475 Dilution used, 1:200
Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 488) Abcam ab150169 Dilution used, 1:500
Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 568) Abcam ab175711 Dilution used, 1:500
Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 647) Abcam ab150171 Dilution used, 1:500
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) Abcam ab150077 Dilution used, 1:200
Recombinant Alexa Fluor 488 Anti-GFAP antibody Abcam ab194324 Dilution used, 1:200
Somatostatin Antibody YC7 Santa Cruz Biotechnology sc-47706 Dilution used, 1:200
Vasoactive intestinal peptide (VIP) ProteinTech 16233-1-AP Dilution used, 1:200

参考文献

  1. Costantini, I., Cicchi, R., Silvestri, L., Vanzi, F., Pavone, F. S. In-vivo and ex-vivo optical clearing methods for biological tissues: review. Biomedical Optics Express. 10 (10), 5251 (2019).
  2. Richardson, D. S., et al. Tissue clearing. Nature Reviews Methods Primers. 1 (1), 84 (2021).
  3. Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).
  4. Weiss, K. R., Voigt, F. F., Shepherd, D. P., Huisken, J. Tutorial: practical considerations for tissue clearing and imaging. Nature Protocols. 16 (6), 2732-2748 (2021).
  5. Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32 (1), 713-741 (2016).
  6. Renier, N., et al. iDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  7. Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
  8. Lee, E., et al. ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Scientific Reports. 6 (1), 18631 (2016).
  9. Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
  10. Lee, H., Park, J. -. H., Seo, I., Park, S. -. H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Developmental Biology. 14 (1), 48 (2014).
  11. Murray, E., et al. Simple, Scalable proteomic imaging for high-dimensional profiling of intact systems. Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).
  12. Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).
  13. Ueda, H. R., et al. Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy. Neuron. 106 (3), 369-387 (2020).
  14. Costantini, I., et al. Large-scale, cell-resolution volumetric mapping allows layer-specific investigation of human brain cytoarchitecture. Biomedical Optics Express. 12 (6), 3684 (2021).
  15. Lai, H. M., et al. Next generation histology methods for three-dimensional imaging of fresh and archival human brain tissues. Nature Communications. 9 (1), 1066 (2018).
  16. Zhao, S., et al. Cellular and molecular probing of intact human organs. Cell. 180 (4), 796-812.e19 (2020).
  17. Costantini, I., et al. Autofluorescence enhancement for label-free imaging of myelinated fibers in mammalian brains. Scientific Reports. 11 (1), 8038 (2021).
  18. Pesce, L., et al. 3D molecular phenotyping of cleared human brain tissues with light-sheet fluorescence microscopy. Communications Biology. 5 (1), 447 (2022).
  19. Schueth, A., et al. Efficient 3D light-sheet imaging of very large-scale optically cleared human brain and prostate tissue samples. Communications Biology. 6 (1), 170 (2023).
  20. Morawski, M., et al. Developing 3D microscopy with CLARITY on human brain tissue: Towards a tool for informing and validating MRI-based histology. NeuroImage. 182, 417-428 (2018).
  21. Park, J., et al. Integrated platform for multi-scale molecular imaging and phenotyping of the human brain. bioRxiv. , (2022).
  22. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  23. Costantini, I., et al. A cellular resolution atlas of Broca’s area. Science Advances. (9), eadg3844 (2023).
  24. Scardigli, M., et al. Comparison of different tissue clearing methods for three-dimensional reconstruction of human brain cellular anatomy using advanced imaging techniques. Frontiers in Neuroanatomy. 15, 752234 (2021).
  25. Pesce, L., et al. Exploring the human cerebral cortex using confocal microscopy. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 168, 3-9 (2022).
  26. Keller, P. J., Dodt, H. -. U. Light sheet microscopy of living or cleared specimens. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 138-143 (2012).
  27. Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nature Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
  28. Belle, M., et al. Tridimensional visualization and analysis of early human development. Cell. 169 (1), 161-173.e12 (2017).
  29. Sorelli, M., et al. Fiber enhancement and 3D orientation analysis in label-free two-photon fluorescence microscopy. Scientific Reports. 13 (1), 4160 (2023).
  30. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  31. Vieites-Prado, A., Renier, N. Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology. Development. 148 (18), dev199369 (2021).
  32. Costantini, I., et al. Editorial: The human brain multiscale imaging challenge. Frontiers in Neuroanatomy. (16), 1060405 (2022).
  33. Costantini, I., et al. A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging. Scientific Reports. 5 (1), 9808 (2015).

Play Video

記事を引用
Di Meo, D., Ramazzotti, J., Scardigli, M., Cheli, F., Pesce, L., Brady, N., Mazzamuto, G., Costantini, I., Pavone, F. S. Optical Clearing and Labeling for Light-sheet Fluorescence Microscopy in Large-scale Human Brain Imaging. J. Vis. Exp. (203), e65960, doi:10.3791/65960 (2024).

View Video