Drosophila'da Şeker Kaynaklı Yerel Arama Davranışının İzlenmesi
概要
Bu protokol, Drosophila melanogaster kullanılarak şeker açığa çıkarılan arama davranışını kaydetmek için davranışsal bir testi açıklar. Test, beslenme ve yiyecek arama ile ilgili davranışların yanı sıra altta yatan nöronal mekanizmaları incelemek için kullanılabilir.
Abstract
Yiyecek arama davranışı, organizmaların temel besin kaynaklarını bulmalarını ve edinmelerini sağladığı için hayatta kalmaları için gereklidir. Drosophila’da açlık, az miktarda şeker çözeltisinin tüketilmesini takiben farklı bir arama davranışını tetikler. Bu rapor, altta yatan mekanizmaları ortaya çıkarmak amacıyla şeker kaynaklı arama davranışını incelemek için basit bir deney düzeneği sunmaktadır. Çok az miktarda konsantre şeker çözeltisi, sineklerde sürekli arama davranışı ortaya çıkarır. Sinekler şeker konumuna geri dönmek için yörüngelerini kullandığından, yol entegrasyonunun bu davranışa katılımı kurulmuştur. En son bulgular, şeker alımından sonra arama davranışının başlatılmasında ve yoğunluğunda zamansal modülasyonun kanıtını sağlar. Bu kurulumu, arama davranışını ortaya çıkaran farenksteki spesifik tat reseptör nöronlarının yapay aktivasyonu için de kullandık. Drosophila nörogenetik araç seti, yiyecek aramanın altında yatan nöral ve genetik mekanizmaları incelemek için şeker açığa çıkaran arama davranışı paradigmasıyla birleştirilebilecek çok çeşitli araçlar ve teknikler sunar. Sineklerde açlığa bağlı arama davranışının sinirsel temelini anlamak, bir bütün olarak nörobiyoloji alanına katkıda bulunur ve yalnızca diğer organizmalarda değil, insanlarda da beslenme davranışlarını yöneten düzenleyici mekanizmalar hakkında fikir verir.
Introduction
Yiyecek arama ve yiyecek arama davranışı, taksonlar arasında organizmalar tarafından sergilenen temel bir hayatta kalma stratejisidir. Böceklerde iki tür yiyecek arama davranışı tanımlanmıştır: açlığa bağlı yiyecek arama ve yemek sonrası yerel arama1. Acıktıklarında, böcekler yiyecek kaynaklarını bulmak için duyusal ipuçlarına güvenirler. Küçük bir yiyecek yamasıyla karşılaşıp tükettikten sonra, dolambaçlı yollarla karakterize edilen ve yiyecek yerinin etrafında dönen yerel bir arama davranışı başlatırlar.
Yerel aramanın belirli bir biçimi olan şekerle ortaya çıkan arama davranışı, ilk olarak 60 yıl önce Amerikalı biyolog Vincent Dethier tarafından sinekler2’de incelenmiştir. Aç kaldıklarında, sineklere onları doyurmayacak kadar az miktarda şeker sunulur, yerel bir aramaya başlarlar. Tipik arama davranışı, düşük lokomotor ve yüksek dönüş hızı ile oldukça dolambaçlı bir yürüyüş ve şeker damlasının bulunduğu yere geri dönüş ile karakterize edilir. Daha sonraki çalışmalarda bu davranış karasineklerde ve meyve sineklerinde araştırılmıştır 3,4. Araştırmanın başlatılması, yoğunluğu ve süresi, hayvanın iç durumu (örneğin, yoksunluk ve motivasyon) ile kaynak mevcudiyeti ve kalitesi gibi dış faktörler tarafından düzenlenir 1,5,6.
İzleme teknolojilerindeki gelişmeler, araştırmacılara kontrollü alanlardaki davranışları yakalamak ve analiz etmek için değerli araçlar sağlamıştır. Burada, şeker alımından sonra serbestçe yürüyen sinekleri izlemek için davranışsal bir paradigma sunuyoruz. Bu basit kurulum, bir arenada sağlanan konsantre şeker çözeltisine yanıt olarak sineğin hareketini yakalayıp analiz ederek Drosophila’da şeker kaynaklı arama davranışının incelenmesini sağlar. Gelişmiş izleme teknolojisi ve veri analizi teknikleri kullanılarak, lokomotor modeller, mekansal keşif ve şeker uyaranlarına tepki dinamikleri başarıyla ölçülmüştür.
Bu tahlil kullanılarak, şeker ortaya çıkan aramanın yol entegrasyonunun kullanımını içerdiği ve şeker alımından mekansal-zamansal olarak ayrılabileceği deneysel olarak gösterilmiştir 7,8. Ayrıca, davranışın faringeal tat nöronlarınınaktivasyonu ile tetiklenebileceği gösterilmiştir 9. Son sonuçlar, şeker uyaranının doğuştan gelen bir salma mekanizması olmadığını, aynı zamanda modülatör olduğunu ve davranışın başlamasını zamansal olarak kontrol ettiğinigöstermektedir 8. Bu paradigmayı kullanarak, bu davranışı bal arılarında da inceledik (Apis mellifera)7,8.
Bu araştırmanın nihai amacı, hedeflenen genetik manipülasyonlar ve nörogörüntüleme teknikleri yoluyla arama davranışının düzenlenmesinde rol oynayan nöral devreleri ve yeni genetik bileşenleri çözmektir. Yiyecek arama davranışlarının, böceklerde navigasyon ve uzamsal hafızayı incelemek için oldukça etkili deneysel paradigmalar olduğu kanıtlanmıştır. Bu davranışlar, sineklerde ödüllendirici besin kaynakları arayışında yer alan duyusal algıyı, karar verme süreçlerini ve motor koordinasyonu araştırmak için eşsiz bir fırsat sağlar. Ek olarak, bu çalışmalardan elde edilen bulgular, birçok temel genetik ve sinirsel mekanizma evrimsel olarak korunduğundan, insanlar da dahil olmak üzere diğer organizmalardaki beslenme davranışlarını anlamak için daha geniş etkilere sahiptir. Beslenme davranışlarının düzensizliği çeşitli nörolojik ve metabolik bozukluklarla ilişkilidir10. Bu nedenle, sineklerde arama davranışının altında yatan sinirsel ve genetik mekanizmalar, bu karmaşık insan sağlığı zorluklarını anlamak ve potansiyel olarak ele almak için yeni yollar sunabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışma, ilk olarak Dethier2 tarafından tanımlanan Drosophila’da şeker kaynaklı arama davranışını araştırmak için basit bir paradigma sunmaktadır. Bu doğuştan gelen davranış, sineklerin bir yiyecek ödülüyle karşılaştıktan sonra ek yiyecek kaynakları için yerel bir arayışa girmelerini sağlar. Deney protokolünün en önemli yönü, sinekleri uygun şekilde motive etmeyi içerir. İlk olarak, sineklerin şeker alımını sağlamak için suya erişimleri varken yiyeceklerden mahrum bırakılmış açlık durumunda olmaları gerekir. Deneysel denemelerde tek tip açlık durumuna sahip olmak için, nüfusun% 90’ının hayatta kaldığı süre açlık süresi olarak kullanılmıştır. En önemlisi, beslenme sonrası bir arama yanıtının başlatılması, yeterli kalitede ancak sinekleri tam olarak doyurmak için yeterli olmayan bir gıda uyaranının sağlanmasını gerektirir. Bu nedenle, şeker konsantrasyonunun ve miktarının ve açlık süresinin standartlaştırılması zaman alıcı olabilir, ancak sağlam ve güvenilir davranış için zorunludur.
Bu çalışmada, aç sinekler için uyarıcı olarak 500 mM, 0.2 μL sükroz çözeltisi kullanılmıştır. Şeker alımı, artan dönme davranışı ve şeker damlasının bulunduğu yere sık sık geri dönüşlerle karakterize edilen karakteristik bir yerel arama davranışını çağrıştırır (Video 1). Tersine, herhangi bir şeker verilmeyen aç sinekler bir arama yanıtı gösteremezler. Özellikle, yol uzunluğu, kalış süresi, menderes ve geri dönüş sayısı dahil olmak üzere davranışla ilgili tüm parametreler, beslenmemiş sineklerde önemli ölçüde daha düşüktü. Daha önce, tek başına su yutulmasının bir arama yanıtı ortaya çıkarmadığını göstermiştik9.
Bu kurulum, bu doğuştan gelen davranışı incelemek için uygun maliyetli ve az bakım gerektiren bir yaklaşım sunar. Bu çalışmada arkadan aydınlatmalı bir arena kullanılırken, sinek ve arka plan arasında yeterli kontrast olduğu sürece üstten aydınlatma da kullanılabilir. Kullanılan izleme yazılımı, statik bir arka plana karşı sinek hareketinin algılanmasına dayanır13. Kamera ve çözünürlük ayarları, incelenen belirli davranış ölçeğine göre ayarlanabilir. Daha da önemlisi, bu metodoloji, yiyecek arama sırasında duyusal işaret dikkati, gıda katılımı ve beslenme, aramanın lokomotor kontrolü ve diğerlerinin yanı sıra sömürü ve keşifle ilgili karar verme süreçleri dahil olmak üzere yiyecek arama davranışının çeşitli bileşenlerinin incelenmesini sağlar. Ayrıca, bu paradigma, çeşitli ekolojik bağlamlarda çeşitli taksonlarda yaygın olarak gözlemlenen bir davranış olan yerel aramanın araştırılmasını kolaylaştırır6. Drosophila’da bu davranışı incelemek, yiyecek aramada yer alan nöral yolları anlamayı amaçlayan bilimsel araştırma için yollar açar. Bal arılarında yerel araştırmayı inceledik ve davranışın sineklerebenzerlik gösterdiğini gösterdik 7,8.
Son çalışmalar, yerel arama davranışının sineklerde çeşitli şeker duyusal nöronlarının optogenetik aktivasyonu ile tetiklenebileceğini göstermiştir 14,15,16. Bununla birlikte, bu çalışmalarda gözlemlenen yerel aramaların, gerçek şeker alımına yanıt olarak sineklerin doğal davranışlarını ne ölçüde doğru bir şekilde temsil ettiği belirsizliğini korumaktadır. Sineklerde beslenme davranışı sıkı bir şekilde düzenlenir ve bu bulgular faringeal şeker reseptörlerinin aktivasyonunun arama davranışını başlattığını gösterir. Tarsal tat sensillaları şekeri tespit etmekten ve hortum uzatma refleksini indüklemekten sorumluyken, faringeal tat nöronları beslenmenin devam edip etmeyeceğini belirler17,18. Yutulduktan sonra, şeker çözeltisi yemek borusundan proventriküle gider ve genişlemesi tekrarlayan bir sinir19 tarafından izlenerek mahsule girer. Ek olarak, yukarıda belirtilen çalışmalardan bazılarının sineklerin kullanılmasını veya hapsedilmesini içerdiğini, oysa bu yöntemin hayvanların deney boyunca serbestçe yürümesine izin verdiğini belirtmekte fayda var. Deneylerimizdeki sinekler, bir kapak dayatmadan arenada kalmak ve aramak için yeterince motive oldular.
Sineklerde arama davranışını yöneten nöral yollar, genetik faktörler ve çevresel ipuçları arasındaki karmaşık etkileşimi anlamak, bilgi işleme, öğrenme ve hafıza oluşumunun temel ilkelerine ışık tutabilir. Ayrıca, yiyecek arama davranışının düzensizliği, yeme bozuklukları ve obezite dahil olmak üzere çeşitli insan bozukluklarında rol oynamıştır. Drosophila’da bulunan kapsamlı nörogenetik araçlar dizisi, şekerle ortaya çıkan arama davranışını araştırmak ve yiyecek aramanın altında yatan sinirsel ve genetik mekanizmaları çözmek için değerli bir kaynak sağlar. Optogenetik manipülasyon ve fonksiyonel görüntüleme ile birlikte, bu paradigma güçlü ve umut verici bir yaklaşım sunmaktadır 20,21,22. Bununla birlikte, optogenetik ile nöronal aktivitenin gerçek zamanlı manipülasyonu için kurulumu değiştirmek zor olabilir. Bir sinek arama davranışını gerçekleştirirken beyindeki nöronal aktiviteyi izlemek için, bir sırt topu üzerindeki bağlı sinek gibi farklı bir kuruluma ihtiyaç duyulacaktır. Beslenme düzenlemesi ve karar verme süreçleri gibi yiyecek arama davranışının birçok yönü, türler arasında yüksek oranda korunur. Bu nedenle, sineklerde yiyecek aramanın sinirsel mekanizmalarının incelenmesinden elde edilen içgörüler, insanlar da dahil olmak üzere diğer organizmalardaki benzer süreçler hakkında değerli bilgiler sağlayabilir.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arenanın kurulmasına yardımcı olduğu için Ravikumar Boyapati’ye teşekkür ederiz. Bu çalışma, Wellcome trust DBT Intermediate India Alliance hibesi (Hibe numarası IA/I/15/2/502074) tarafından PK’ye finanse edilmektedir. A.B., NCBS-TIFR kurumsal fonları (No. 12P4167) ve Hindistan Hükümeti Atom Enerjisi Departmanı (No. 12-R& D-TFR-5.04-0800 ve 12-R& D-TFR-5.04-0900).
Materials
| 2 mL Eppendorf tube | Sigma Aldrich | BR780546 | Used to introduce the fly to the sugar drop |
| Agar | SRL | 9002-18-0 | |
| Azure lens | https://www.rmaelectronics.com/azure-photonics-azure-1214mm/ | ||
| Camera | Logicool, Japan | ||
| Corn flour | locally available | ||
| Ctrax software | https://ctrax.sourceforge.net/ | ||
| D-glucose | SRL | 50-99-7 | |
| Flea3 | Sony | https://www.flir.com/products/flea3-usb3/?vertical=machine+vision&segment=iis | |
| glass tube | Borosil | Used to house the flies individually | |
| Kimwipe | Kimberly-Clark | 34155 | Used to provide access to water for flies during food starvation |
| LED light panel | custom-made in the workshop | ||
| Light Meter | TENMARS | TM-203 | |
| Methyl 4-hydroxybenzoate | Fisher Scientific | 99-76-3 | |
| Orthophosphotic acid | SRL | 7664-38-2 | |
| Petri dish (90 mm) | Tarsons | 460090 | |
| Propionic acid | SRL | 79-09-4 | |
| Sucrose | Qualigens | Q28105 | |
| Sugar | locally available | ||
| VirtualDub | https://www.virtualdub.org/ | ||
| White polyvinyl chloride pipe (67 mm inner diameter × 100 mm height) | custom-made in the workshop | ||
| Yeast powder | SRL | REF-34266 |
参考文献
- Jander, R. Ecological aspects of spatial orientation. Annu Rev Ecol Evol Syst. 6 (1), 171-188 (1975).
- Dethier, V. G. Communication by insects: Physiology of dancing. Science. 125 (3243), 331-336 (1957).
- White, J., Tobin, T. R., Bell, W. J. Local search in the housefly Musca domestica after feeding on sucrose. J. Insect Physiol. 30 (6), 477-487 (1984).
- Bell, W. J., Cathy, T., Roggero, R. J., Kipp, L. R., Tobin, T. R. Sucrose stimulated searching behaviour of Drosophila melanogaster in a uniform habitat: modulation by period of deprivation. Animal Behav. 33, 436-448 (1985).
- Dethier, V. G. Microscopic Brains. Science. 143 (3611), 1138-1145 (1964).
- Bell, W. J. Searching behavior patterns in insects. Annu Rev Entomol. 35 (1), 447-467 (1990).
- Brockmann, A., et al. Sugar intake elicits intelligent searching behavior in flies and honey bees. Front Behav Neurosci. 12, 280 (2018).
- Shakeel, M., Brockmann, A. Temporal effects of sugar intake on fly local search and honey bee dance behaviour. J Comp Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol. , (2023).
- Murata, S., Brockmann, A., Tanimura, T. Pharyngeal stimulation with sugar triggers local searching behavior in Drosophila. J Exp Biol. 220 (Pt 8), 3231-3237 (2017).
- Nishijo, H., Ono, T. Neural mechanisms of feeding behavior and its disorders new insights into metabolic syndrome. IntechOpen. , (2021).
- Carvalho, G. B., Kapahi, P., Anderson, D. J., Benzer, S. Allocrine modulation of feeding behavior by the sex peptide of Drosophila. Curr Biol. 16 (7), 692-696 (2006).
- Xu, K., Zheng, X., Sehgal, A. Regulation of feeding and metabolism by neuronal and peripheral clocks in Drosophila. Cell Metab. 8 (4), 289-300 (2008).
- Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nat Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
- Corfas, R. A., Sharma, T., Dickinson, M. H. Diverse food-sensing neurons trigger idiothetic local search in Drosophila. Curr Biol. 29 (10), 1660-1668.e4 (2019).
- Behbahani, A. H., Palmer, E. H., Corfas, R. A., Dickinson, M. H. Drosophila re-zero their path integrator at the center of a fictive food patch. Curr Biol. 31 (20), 4534-4546.e5 (2021).
- Titova, A. V., et al. Displacement experiments provide evidence for path integration in Drosophila. J Exp Biol. 226 (12), jeb245289 (2023).
- Stocker, R. F. The organization of the chemosensory system in Drosophila melanogaster: a review. Cell Tissue Res. 275 (1), 3-26 (1994).
- LeDue, E. E., Chen, Y. C., Jung, A. Y., Dahanukar, A., Gordon, M. D. Pharyngeal sense organs drive robust sugar consumption in Drosophila. Nat Commun. 6, 6667 (2015).
- Gelperin, A. Abdominal sensory neurons providing negative feedback to the feeding behavior of the blowfly. Zeitschrift für vergleichende Physiologie. 72 (1), 17-31 (1971).
- Simpson, J. H., Looger, L. L. Functional imaging and optogenetics in Drosophila. 遺伝学. 208 (4), 1291-1309 (2018).
- DeAngelis, B. D., Zavatone-Veth, J. A., Gonzalez-Suarez, A. D., Clark, D. A. Spatiotemporally precise optogenetic activation of sensory neurons in freely walking Drosophila. Elife. 9, e54183 (2020).
- Grover, D., Katsuki, T., Li, J., Dawkins, T. J., Greenspan, R. J. Imaging brain activity during complex social behaviors in Drosophila with Flyception2. Nat Commun. 11 (1), 623 (2020).
