초파리에서 설탕 유도 국소 검색 행동 추적
概要
이 프로토콜은 Drosophila melanogaster를 사용하여 설탕 유도 검색 행동을 기록하기 위한 행동 분석을 설명합니다. 이 분석은 먹이 및 먹이 찾기 관련 행동뿐만 아니라 기본 신경 메커니즘을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
Abstract
먹이 찾기 행동은 유기체가 필수 식량 자원을 찾고 획득할 수 있도록 하기 때문에 유기체의 생존에 필수적입니다. 초파리(Drosophila)에서 배고픔은 소량의 설탕 용액을 섭취한 후 뚜렷한 검색 행동을 유발합니다. 이 보고서는 근본적인 메커니즘을 밝히기 위해 설탕 유도 검색 행동을 연구하기 위한 간단한 실험 설정을 제시합니다. 극소량의 농축된 설탕 용액은 파리의 지속적인 탐색 행동을 유도합니다. 이 행동에서 경로 통합의 관여는 파리가 자신의 궤적을 활용하여 설탕 위치로 돌아가기 때문에 확립되었습니다. 가장 최근의 발견은 설탕 섭취 후 탐색 행동의 시작과 강도에 대한 시간적 조절의 증거를 제공합니다. 우리는 또한 인두에서 특정 미각 수용체 뉴런의 인위적인 활성화를 위해 이 설정을 사용하여 검색 행동을 유도했습니다. 초파리 신경유전학 툴킷은 채집의 기초가 되는 신경 및 유전적 메커니즘을 연구하기 위해 설탕 유도 검색 행동 패러다임과 결합할 수 있는 다양한 도구와 기술을 제공합니다. 파리의 배고픔에 의한 탐색 행동의 신경 기초를 이해하는 것은 신경 생물학 분야 전체에 기여하여 다른 유기체뿐만 아니라 인간의 섭식 행동을 지배하는 조절 메커니즘에 대한 통찰력을 제공합니다.
Introduction
먹이를 찾고 먹이를 찾는 행동은 분류군 전반에 걸쳐 유기체가 보여주는 기본적인 생존 전략입니다. 곤충에서 먹이를 찾는 행동의 두 가지 유형이 확인되었는데, 배고픔으로 인한 먹이 찾기와 식사 후 지역 찾기가 그것이다1. 배가 고플 때 곤충은 먹이를 찾기 위해 감각 신호에 의존합니다. 작은 먹이 밭을 발견하고 먹으면 뒤얽힌 경로와 먹이 위치 주위를 맴도는 것이 특징인 지역 탐색 행동을 시작합니다.
지역 검색의 특정 형태인 설탕 유도 검색 행동은 60여 년 전 미국 생물학자 빈센트 데티어(Vincent Dethier)가 ‘blowflies2‘에서 처음 연구했다. 굶주리면 파리에게 소량의 설탕을 주어 포만감을 주지 않고 지역 검색을 시작합니다. 일반적인 탐색 행동은 낮은 운동성과 높은 회전 속도로 매우 구불구불한 걸음을 걷고 설탕이 떨어진 위치로 돌아가는 것이 특징입니다. 후속 연구에서는 집파리와 초파리에서 이러한 행동을 조사했습니다 3,4. 탐색의 시작, 강도 및 기간은 동물의 내부 상태(예: 박탈 및 동기)뿐만 아니라 자원 가용성 및 품질과 같은 외부 요인에 의해 조절된다 1,5,6.
추적 기술의 발전은 연구자들에게 통제된 영역 내에서 행동을 포착하고 분석할 수 있는 귀중한 도구를 제공했습니다. 여기에서는 설탕 섭취 후 자유롭게 걷는 파리를 추적하기 위한 행동 패러다임을 제시합니다. 이 간단한 설정을 통해 경기장에서 제공되는 농축된 설탕 용액에 대한 반응으로 파리의 움직임을 포착하고 분석하여 초파리 에서 설탕으로 유도된 검색 행동을 연구할 수 있습니다. 고급 추적 기술 및 데이터 분석 기술을 사용하여 운동 패턴, 공간 탐색 및 당 자극에 대한 반응 역학을 성공적으로 정량화했습니다.
이 분석을 사용하여, 당-유도 검색은 경로 통합의 사용을 포함하며, 당 섭취량으로부터 공간적-시간적으로 분리될 수 있다는 것이 실험적으로 입증되었다 7,8. 또한, 이러한 행동은 인두 미각 뉴런(pharyngeal taste neuron)의 활성화에 의해 유발될 수 있음이 밝혀졌다9. 최근의 연구 결과에 의하면 설탕 자극은 선천적인 방출 기전이 아니라 조절적이기도 하며, 행동의 시작을 시간적으로 조절한다8. 이 패러다임을 사용하여 꿀벌(Apis mellifera)7,8에서도 이러한 행동을 연구했습니다.
이 연구의 궁극적인 목표는 표적 유전자 조작 및 신경 영상 기술을 통해 탐색 행동을 조절하는 데 관여하는 신경 회로와 새로운 유전 구성 요소를 밝히는 것입니다. 먹이 탐색 행동은 곤충의 탐색과 공간 기억을 연구하는 데 매우 효과적인 실험 패러다임임이 입증되었습니다. 이러한 행동은 파리의 먹이 공급원을 찾는 것과 관련된 감각 지각, 의사 결정 과정 및 운동 협응을 조사할 수 있는 독특한 기회를 제공합니다. 또한 이러한 연구의 결과는 많은 근본적인 유전 및 신경 메커니즘이 진화적으로 보존됨에 따라 인간을 포함한 다른 유기체의 섭식 행동을 이해하는 데 더 광범위한 영향을 미칩니다. 섭식 행동의 조절 장애는 다양한 신경 및 대사 장애와 관련이 있다10. 따라서 파리의 탐색 행동의 기저에 있는 신경 및 유전적 메커니즘은 이러한 복잡한 인간 건강 문제를 이해하고 잠재적으로 해결할 수 있는 새로운 길을 제공할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
현재 연구는 Dethier2에 의해 처음 기술된 초파리의 설탕 유도 검색 행동을 조사하기 위한 간단한 패러다임을 소개합니다. 이 타고난 행동은 파리가 먹이 보상을 만난 후 추가 먹이 자원을 찾기 위해 지역 검색에 참여할 수 있도록합니다. 실험 프로토콜의 가장 중요한 측면은 파리에게 적절한 동기를 부여하는 것입니다. 첫째, 파리는 설탕 섭취를 보장하기 위해 물을 마실 수 있는 동안 음식을 먹지 못한 굶주린 상태여야 합니다. 실험 전반에 걸쳐 균일한 배고픔 상태를 유지하기 위해 인구의 90%가 생존하는 기간을 기아 기간으로 사용했습니다. 결정적으로, 먹이를 먹은 후 탐색 반응을 유도하려면 충분한 품질의 음식 자극을 제공해야 하지만 파리를 완전히 만족시키기에는 충분하지 않습니다. 따라서 설탕의 농도와 양, 굶주림 기간을 표준화하는 것은 시간이 많이 걸릴 수 있지만 강력하고 신뢰할 수 있는 행동을 위해 필수적입니다.
이 연구에서는 굶주린 파리에 대한 자극으로 500mM, 0.2μL 자당 용액을 사용했습니다. 설탕 섭취는 회전 행동이 증가하고 설탕이 떨어진 위치로 자주 돌아가는 특징적인 국소 탐색 행동을 유발합니다(비디오 1). 반대로, 설탕이 제공되지 않은 배고픈 파리는 검색 반응을 나타내지 않습니다. 특히, 경로 길이, 체류 시간, 사행, 귀환 횟수를 포함한 모든 행동 관련 매개변수는 먹이를 먹지 않은 파리에서 유의하게 낮았습니다. 우리는 이전에 물을 섭취하는 것만으로는 검색 응답(search response)9을 유도하지 못한다는 것을 증명한 바 있다.
이 설정은 이 타고난 행동을 연구하기 위한 비용 효율적이고 유지 보수가 적은 접근 방식을 제공합니다. 이 연구에서는 백라이트 경기장을 사용하지만 파리와 배경 사이에 충분한 대비가 있는 한 상단 조명도 사용할 수 있습니다. 사용된 추적 소프트웨어는 정적 배경(13)에 대한 파리 이동의 감지에 의존한다. 카메라 및 해상도 설정은 조사 중인 동작의 특정 규모에 따라 조정할 수 있습니다. 중요한 것은 이 방법론을 통해 먹이를 찾는 동안의 감각적 단서 주의, 먹이 섭취 및 먹이 주기, 탐색의 운동 제어, 착취 및 탐험과 관련된 의사 결정 과정 등 먹이 찾기 행동의 다양한 구성 요소를 연구할 수 있다는 것입니다. 더욱이, 이 패러다임은 다양한 생태학적 맥락에서 다양한 분류군에서 공통적으로 관찰되는 행동인 지역 탐색의 조사를 용이하게 한다6. 초파리에서 이러한 행동을 연구하면 먹이 찾기와 관련된 신경 경로를 이해하기 위한 과학적 탐구의 길이 열립니다. 우리는 꿀벌의 지역 검색을 연구했으며 그 행동이 파리와 유사하다는 것을 보여주었습니다 7,8.
최근의 연구들은 국소 탐색 행동이 파리의 다양한 당 감각 뉴런의 광유전학적 활성화에 의해 촉발될 수 있다는 것을 보여주었다 14,15,16. 그러나 이 연구에서 관찰된 지역 검색이 실제 설탕 섭취에 대한 파리의 자연스러운 행동을 어느 정도 정확하게 나타내는지는 불분명합니다. 먹이 행동은 파리에서 엄격하게 조절되며, 이러한 발견은 인두 당 수용체의 활성화가 탐색 행동을 시작한다는 것을 나타냅니다. 족근 미각 감각은 당을 감지하고 확장 반사를 유도하는 역할을 하는 반면, 인두 미각 뉴런은 수유를 진행해야 하는지 여부를 결정합니다17,18. 일단 섭취되면, 설탕 용액은 식도를 통해 전방(proventriculus)으로 이동하여 작물로 들어가며, 그 팽창은 재발성 신경(recurrent nerve)에 의해 모니터링된다19. 또한 앞서 언급한 연구 중 일부는 파리를 이용하거나 감금하는 것과 관련이 있는 반면, 이 방법을 사용하면 동물이 실험 내내 자유롭게 걸을 수 있다는 점에 주목할 가치가 있습니다. 우리 실험에 참여한 파리들은 뚜껑을 열지 않고 경기장 안에 머물며 수색할 수 있는 충분한 동기를 가지고 있었다.
파리의 탐색 행동을 지배하는 신경 경로, 유전 요인 및 환경 단서 간의 복잡한 상호 작용을 이해하면 정보 처리, 학습 및 기억 형성의 기본 원리를 밝힐 수 있습니다. 또한, 먹이 찾기 행동의 조절 장애는 섭식 장애 및 비만을 포함한 다양한 인간 장애와 관련이 있습니다. 초파리에서 사용할 수 있는 광범위한 신경유전학적 도구는 설탕 유도 탐색 행동을 조사하고 먹이 찾기의 기저에 있는 신경 및 유전 메커니즘을 밝히는 데 귀중한 리소스를 제공합니다. 광유전학적 조작 및 기능적 이미징과 함께 이 패러다임은 강력하고 유망한 접근 방식을 제시합니다20,21,22. 그러나 광유전학을 사용하여 신경 활동을 실시간으로 조작하기 위한 설정을 수정하는 것은 어려울 수 있습니다. 파리가 탐색 행동을 수행하는 동안 뇌의 신경 활동을 모니터링하려면 트레드 볼에 묶인 파리와 같은 다른 설정이 필요합니다. 먹이 조절 및 의사 결정 과정과 같은 먹이 찾기 행동의 많은 측면은 종에 따라 매우 잘 보존됩니다. 따라서 파리의 먹이 찾기의 신경 메커니즘을 연구하여 얻은 통찰력은 인간을 포함한 다른 유기체의 유사한 과정에 대한 귀중한 통찰력을 제공할 수 있습니다.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
경기장 설치에 도움을 주신 Ravikumar Boyapati에게 감사드립니다. 이 연구는 웰컴 트러스트 DBT Intermediate India Alliance 보조금(보조금 번호 IA/I/15/2/502074)의 지원을 받아 P.K. M.S.가 인도 의학 연구 위원회(ICMR)의 펠로우십을 통해 자금을 지원받았습니다. AB는 NCBS-TIFR 기관 기금(No. 12P4167)과 인도 정부 원자력부(No. 12-R& D-TFR-5.04-0800 및 12-R& D-TFR-5.04-0900)을 참조하십시오.
Materials
| 2 mL Eppendorf tube | Sigma Aldrich | BR780546 | Used to introduce the fly to the sugar drop |
| Agar | SRL | 9002-18-0 | |
| Azure lens | https://www.rmaelectronics.com/azure-photonics-azure-1214mm/ | ||
| Camera | Logicool, Japan | ||
| Corn flour | locally available | ||
| Ctrax software | https://ctrax.sourceforge.net/ | ||
| D-glucose | SRL | 50-99-7 | |
| Flea3 | Sony | https://www.flir.com/products/flea3-usb3/?vertical=machine+vision&segment=iis | |
| glass tube | Borosil | Used to house the flies individually | |
| Kimwipe | Kimberly-Clark | 34155 | Used to provide access to water for flies during food starvation |
| LED light panel | custom-made in the workshop | ||
| Light Meter | TENMARS | TM-203 | |
| Methyl 4-hydroxybenzoate | Fisher Scientific | 99-76-3 | |
| Orthophosphotic acid | SRL | 7664-38-2 | |
| Petri dish (90 mm) | Tarsons | 460090 | |
| Propionic acid | SRL | 79-09-4 | |
| Sucrose | Qualigens | Q28105 | |
| Sugar | locally available | ||
| VirtualDub | https://www.virtualdub.org/ | ||
| White polyvinyl chloride pipe (67 mm inner diameter × 100 mm height) | custom-made in the workshop | ||
| Yeast powder | SRL | REF-34266 |
参考文献
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