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行動学

Verfolgung des durch Zucker ausgelösten lokalen Suchverhaltens in Drosophila

Published: November 17, 2023
doi:
10.3791/65955
, , , ,
1National Centre for Biological Sciences, 2The University of Trans-Disciplinary Health Sciences and Technology, 3Regional Centre for Biotechnology, 4Neural Circuit Group, Division of Biological Science, Graduate School of Science,Nagoya University, 5Perelman School of Medicine,University of Pennsylvania

概要

Dieses Protokoll beschreibt einen Verhaltensassay zur Aufzeichnung des durch Zucker ausgelösten Suchverhaltens mit Drosophila melanogaster. Der Assay kann verwendet werden, um das Fress- und Futtersuchverhalten sowie die zugrunde liegenden neuronalen Mechanismen zu untersuchen.

Abstract

Das Futtersuchverhalten ist für Organismen überlebenswichtig, da es ihnen ermöglicht, wichtige Nahrungsressourcen zu finden und zu erwerben. Bei Drosophila löst der Hunger nach dem Verzehr kleiner Mengen einer Zuckerlösung ein ausgeprägtes Suchverhalten aus. Dieser Bericht stellt einen einfachen Versuchsaufbau vor, um das durch Zucker ausgelöste Suchverhalten zu untersuchen, mit dem Ziel, die zugrunde liegenden Mechanismen aufzudecken. Kleinste Mengen konzentrierter Zuckerlösung lösen bei Fliegen ein anhaltendes Suchverhalten aus. Die Beteiligung der Pfadintegration an diesem Verhalten wurde festgestellt, da Fliegen ihre Flugbahn nutzen, um zum Zuckerort zurückzukehren. Die neuesten Erkenntnisse liefern Hinweise auf eine zeitliche Modulation in der Initiierung und Intensität des Suchverhaltens nach Zuckeraufnahme. Wir haben diesen Aufbau auch für die künstliche Aktivierung spezifischer Geschmacksrezeptor-Neuronen im Rachen verwendet, die das Suchverhalten auslösen. Das neurogenetische Toolkit von Drosophila bietet eine Vielzahl von Werkzeugen und Techniken, die mit dem Paradigma des zuckerinduzierten Suchverhaltens kombiniert werden können, um die neuronalen und genetischen Mechanismen zu untersuchen, die der Nahrungssuche zugrunde liegen. Das Verständnis der neuronalen Grundlagen des hungergetriebenen Suchverhaltens bei Fliegen trägt zur gesamten Neurobiologie bei und bietet Einblicke in die Regulationsmechanismen, die das Fressverhalten nicht nur in anderen Organismen, sondern auch beim Menschen steuern.

Introduction

Nahrungssuche und Nahrungssuche sind eine grundlegende Überlebensstrategie von Organismen in allen Taxa. Bei Insekten wurden zwei Arten von Nahrungssuche identifiziert: hungerinduzierte Nahrungssuche und lokale Suche nach dem Essen1. Wenn Insekten hungrig sind, verlassen sie sich auf sensorische Hinweise, um Nahrungsquellen zu finden. Wenn sie auf ein kleines Nahrungsfeld stoßen und es verzehren, initiieren sie ein lokales Suchverhalten, das durch verschlungene Wege und das Kreisen um den Nahrungsort gekennzeichnet ist.

Das durch Zucker ausgelöste Suchverhalten, eine besondere Form der lokalen Suche, wurde erstmals vor über 60 Jahren von dem amerikanischen Biologen Vincent Dethier in Schmeißfliegenuntersucht 2. Wenn Fliegen verhungert sind, wird ihnen eine kleine Menge Zucker präsentiert, damit er sie nicht sättigt, sie beginnen mit der lokalen Suche. Typisches Suchverhalten ist gekennzeichnet durch einen sehr gewundenen Gang mit geringer Fortbewegung und hoher Wendegeschwindigkeit und Rückkehr zum Ort des Zuckertropfens. Nachfolgende Studien hatten dieses Verhalten bei Stubenfliegen und Fruchtfliegen untersucht 3,4. Die Initiierung, Intensität und Dauer der Suche wird durch den inneren Zustand des Tieres (z. B. Deprivation und Motivation) sowie durch externe Faktoren wie Ressourcenverfügbarkeit und -qualität bestimmt 1,5,6.

Fortschritte in der Tracking-Technologie haben Forschern wertvolle Werkzeuge an die Hand gegeben, um das Verhalten in kontrollierten Arenen zu erfassen und zu analysieren. Hier stellen wir ein Verhaltensparadigma zur Verfolgung frei laufender Fliegen nach Zuckeraufnahme vor. Dieser einfache Aufbau ermöglicht die Untersuchung des durch Zucker ausgelösten Suchverhaltens in Drosophila , indem die Bewegung der Fliege als Reaktion auf konzentrierte Zuckerlösung, die in einer Arena bereitgestellt wird, erfasst und analysiert wird. Mit Hilfe fortschrittlicher Tracking-Technologie und Datenanalysetechniken wurden die Bewegungsmuster, die räumliche Erkundung und die Reaktionsdynamik auf Zuckerreize erfolgreich quantifiziert.

Mit diesem Assay wurde experimentell gezeigt, dass die zuckerinduzierte Suche die Verwendung von Pfadintegration beinhaltet und räumlich-zeitlich von der Zuckeraufnahme getrennt werden kann 7,8. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass das Verhalten durch die Aktivierung von pharyngealen Geschmacksneuronen ausgelöst werden kann9. Jüngste Ergebnisse zeigen, dass Zuckerreize kein angeborener Freisetzungsmechanismus sind, sondern auch modulatorisch sind und die Initiierung des Verhaltens zeitlich steuern8. Mit diesem Paradigma haben wir dieses Verhalten auch bei Honigbienen (Apis mellifera) untersucht7,8.

Das letztendliche Ziel dieser Forschung ist es, neuronale Schaltkreise und neuartige genetische Komponenten zu entschlüsseln, die an der Regulierung des Suchverhaltens beteiligt sind, durch gezielte genetische Manipulationen und Neuroimaging-Techniken. Das Nahrungssuchverhalten hat sich als hochwirksames experimentelles Paradigma zur Untersuchung der Navigation und des räumlichen Gedächtnisses bei Insekten erwiesen. Diese Verhaltensweisen bieten eine einzigartige Gelegenheit, die sensorische Wahrnehmung, Entscheidungsprozesse und motorische Koordination zu untersuchen, die bei der Suche nach lohnenden Nahrungsquellen bei Fliegen eine Rolle spielen. Darüber hinaus haben die Ergebnisse dieser Studien breitere Auswirkungen auf das Verständnis des Fressverhaltens in anderen Organismen, einschließlich des Menschen, da viele grundlegende genetische und neuronale Mechanismen evolutionär konserviert sind. Eine Dysregulation des Fressverhaltens ist mit verschiedenen neurologischen und metabolischen Störungen verbunden10. Daher können die neuronalen und genetischen Mechanismen, die dem Suchverhalten von Fliegen zugrunde liegen, neue Wege bieten, um diese komplexen Herausforderungen für die menschliche Gesundheit zu verstehen und möglicherweise anzugehen.

Protocol

Für die vorliegende Studie wurden adulte männliche Fliegen des Wildtyp-Stammes Drosophila melanogaster Canton-S (CS) verwendet. 1. Experimentelle Vorbereitung FliegenaufzuchtSammeln Sie erwachsene männliche Fliegen, die innerhalb von 12 Stunden schlüpfen, und halten Sie sie 48 Stunden lang bei 25 °C und 75 % relativer Luftfeuchtigkeit in einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus auf Standard-Fliegenmedien (im Haus hergestellt).HINWEIS: Die verwendete Drosophila-Medienzusammensetzung war (für 1 l Medien) Maismehl (80 g), D-Glucose (20 g), Zucker (40 g), Agar (8 g), Hefepulver (15 g), Propionsäure (4 ml), Methyl-4-hydroxybenzoat (1,25 g in 3 ml Ethanol) und Orthophosphorsäure (600 μl) (siehe Materialtabelle). Die anfängliche Fütterungszeit stellt sicher, dass die Fliegen vor der Hungerphase Zugang zu ausreichend Nahrung und Nährstoffen haben. Während sowohl männliche als auch weibliche Fliegen das Suchverhalten hervorrufen, ist die Hungerzeit bei männlichen Fliegen konsistenter. Außerdem ändern weibliche Fliegen ihre Fresspräferenz nach der Paarung11. Verfahren zum AushungernNach der Fütterungszeit hungern Sie die Fliegen aus, aber mit Zugang zu Wasser.HINWEIS: Um den Hungerzustand über Versuche und Stämme hinweg zu standardisieren, wird empfohlen, die Dauer des 90%igen Überlebens der Bevölkerung unter Bedingungen mit Nahrungsmittelmangel zu bestimmen. Basierend auf diesem Ergebnis wurden CS-Fliegen 28 Stunden lang ausgehungert (Abbildung 1A), da zirkadiane Rhythmen und andere Faktoren das Suchverhalten beeinflussen können12. Zirkadiane Veränderungen der Fliegensuchaktivitäten zu verschiedenen Tageszeiten wurden ebenfalls gemessen (Abbildung 1B). Wir haben bei Fliegen eine geringere relative Suchaktivität in der Nacht im Vergleich zur Lichtphase festgestellt. Berechnen Sie die Hungertoleranz, indem Sie zwei Tage alten Fliegen die Nahrung entziehen. Legen Sie 15-20 Fliegen in ein Fläschchen mit getränktem Seidenpapier am Boden. Dieser dient als Bodengrund und sorgt dafür, dass die Fliegen während der gesamten Hungerzeit Zugang zu Wasser haben. Zählen Sie die Anzahl der Fliegen während der Hungerperiode in regelmäßigen Abständen von 1 h. Die Dauer, in der 90 % der ausgehungerten Fliegen überlebten, wurde als Hungerperiode verwendet (Abbildung 1A). Verwenden Sie mehrere Wiederholungen (3-4 für jeden Stamm), um die Auswirkungen einzelner Variationen zu minimieren und eine zuverlässigere Bewertung der Hungertoleranz zu erhalten.HINWEIS: Die Hungertoleranz jedes Stammes wurde bestimmt, um einen standardisierten Hungerzustand zwischen verschiedenen Stämmen und Experimenten zu ermitteln. Durch das Zählen der überlebenden Fliegen in diesen Intervallen kann man die Überlebensrate im Laufe der Zeit überwachen und bestimmen, wie lange jeder Stamm Nahrungsentzug tolerieren konnte, bevor er dem Hungertod erlag. Verfahren zur Aufzeichnung des VerhaltensÜbertragen Sie einzelne ausgehungerte Fliegen in kleine Röhrchen (Abbildung 2A). Tun Sie dies in Chargen von 5-6 Fliegen, um die Isolationszeit zu minimieren. Durch das Testen einzelner Fliegen, bei dem jede Fliege isoliert wird, können alle beobachteten Veränderungen oder Aktionen der beobachteten Fliege zugeordnet werden, anstatt durch Interaktionen mit anderen Fliegen beeinflusst zu werden. Verwenden Sie 90-mm-Petrischalen als Arena für Verhaltenstests (größere Petrischalen können verwendet werden). Es gab keinen Unterschied im Verhalten bei Petrischalen mit größerem Durchmesser). Beleuchten Sie die Arena von unten mit einer Platte aus oberflächenmontierten kaltweißen LEDs (Abbildung 2B, C). Um eine einheitliche visuelle Umgebung zu erhalten und die Ablenkung von außen zu minimieren, umgeben Sie die Versuchsarena mit einem weißen Polyvinylchloridrohr (51,5 mm Höhe, 114 mm Innendurchmesser).HINWEIS: Dieses Rohr fungiert als Barriere und verhindert, dass visuelle Reize von außerhalb der Arena das Verhalten der Fliege beeinflussen. Durch die Reduzierung externer Ablenkungen kann man sich ausschließlich auf die Interaktion der Fliege mit der Nahrungsquelle konzentrieren und die Konsistenz während des gesamten Experiments aufrechterhalten. Verwenden Sie eine Lichtintensität von 320 Lux in der Mitte der Arena. Positionieren Sie 0,2 μl Zuckerlösung in der Mitte der Arena. In den berichteten Experimenten wurde 500 mM Saccharoselösung verwendet, dies kann jedoch variiert werden. Führen Sie die Fliege mit einem 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen in die Arena ein (Innendurchmesser 8,7 mm, Länge durch Stopfen von Baumwolle am Boden auf 5 mm reduziert; Abbildung 2A) eine einzelne Fliege, die über dem Zuckertropfen umgedreht war. Sobald die Fliege beginnt, das Tröpfchen aufzunehmen, entfernen Sie den Fliegenbehälter und geben Sie der Fliege uneingeschränkten Zugang zur Nahrungsquelle. Filmen Sie die 2D-Position der Arena mit einer Overhead-Kamera.HINWEIS: Flea3 (Point Grey, 1214-mm-Objektiv, siehe Materialtabelle) wurde für die vorliegende Studie verwendet und mit 40 Bildern pro Sekunde (fps) aufgenommen. Es kann jedoch jede Kamera verwendet werden, die einen guten Kontrast zum Hintergrund bietet. Man kann mit 30-60 fps aufnehmen, je nach Art des Experiments. Nehmen Sie in .avi Format auf, da es mit der Tracking-Software kompatibel ist. Zeichnen Sie den Versuch auf, bis die Fliege aus der Arena entkommen ist. Die Fliegen liefen frei und es gab keinen Deckel auf der Arena. Indem Sie der Fliege die Entscheidung überlassen, wann sie mit der Suche aufhört, wegfliegt oder an den Rand der Arena geht, beobachten Sie das natürliche Verhalten der Fliege und die Strategie der Nahrungssuche. Wischen Sie die Petrischalen zwischen den Versuchen mit 70% Ethanol ab und trocknen Sie sie vollständig ab oder verwenden Sie eine neue Petrischale.HINWEIS: Es ist wichtig, alle Experimente zwischen 2 und 6 Stunden nach dem Einschalten des Lichts durchzuführen, wenn die Fliegen konstant hohe Aktivitätsniveaus aufweisen. Dieser Zeitrahmen stellt sicher, dass sich die Fliegen in einem aktiven Zustand befinden, wodurch die Chancen maximiert werden, ihr natürliches Nahrungssuchverhalten zu beobachten und die Auswirkungen anderer Faktoren zu reduzieren, die ihr Verhalten beeinflussen können, wie z. B. zirkadiane Rhythmen. Das Verhaltens-Setup war in einem temperatur- und feuchtigkeitskontrollierten Raum untergebracht. Die Arena wurde auf einen vibrationsfreien Tisch gestellt. Bei diesem Versuchsaufbau wurden einzelne Fliegen isoliert und auf ihre Reaktion auf Zucker getestet. Den ausgehungerten Fliegen wurde ein Zuckertropfen verabreicht und ihr Verhalten wurde auf Video aufgezeichnet (Abbildung 2B, C, Video 1). Die Experimente wurden in einem bestimmten Zeitraum durchgeführt, in dem die Fliegen konstant hohe Aktivitätsniveaus zeigten. Analysieren Sie die Trajektorien nach Schritt 2, um das Suchverhalten zu bestimmen. 2. Analyse von Trajektorien für die lokale Suche Analysieren Sie die aufgezeichneten Videos mit der Ctrax-Software11 (siehe Materialtabelle).HINWEIS: Die Software verfolgt und wandelt die Position der Fliege im Video in x- und y-Koordinaten um, was eine präzise Verfolgung und Analyse ihrer Bewegungen ermöglicht. Siehe Zusatzdatei 1 für Details zur Verwendung von Ctrax. Unterteilen Sie die Trajektorien in zwei Phasen: die anfängliche Fütterungsphase und die Suchphase. Definieren Sie das Ende der Fütterung und den Beginn des Gehens als Fliegen, die sich mit einer Geschwindigkeit >4 mm s-1 in drei aufeinanderfolgenden Bildern bewegen.HINWEIS: Nachdem die Fütterung beendet war, wurde der Rest der Flugbahn als Suchantwort der Fliegen verwendet. In dieser Studie wurde VirtualDub (siehe Materialtabelle) verwendet, um die Fütterungsphase vor dem Tracking aus den Videos zu entfernen. Quantifizieren Sie die Suche anhand der folgenden Parameter:Weglänge: Dieser Parameter stellt die Strecke dar, die die Fliege von ihrem Startpunkt während der Nahrungssuche zurückgelegt hat (in mm). Aufenthaltszeit: Die Zeit, die die Fliegen während der Suche verbringen (in s). Es zeigt die Dauer der Suche und die Beharrlichkeit der Fliege bei der Nahrungssuche an. Mäander: Berechnen Sie dies als Verhältnis, indem Sie die Luftlinie (den Abstand zwischen dem ersten und dem letzten Punkt des Pfades) des Pfades durch die Gesamtpfadlänge dividieren und von 1 subtrahieren. Hohe Mäanderwerte deuten auf mehr Tortuosität in der Flugbahn hin. Anzahl der Retouren: Verwenden Sie den entwickelten Algorithmus, um die Anzahl der Retouren mithilfe von zwei konzentrischen Kreisen zu identifizieren und zu zählen.HINWEIS: Ein innerer Kreis, der den Ursprung der Suche, Rin (2,5 mm) angibt, und der äußere Kreis, der den Mindestabstand Rout (4 mm) angibt, den die Fliege vom Ursprung entfernen musste. Eine Rückkehr wurde definiert als eine Bewegung aus dem äußeren Kreis (Rout) und dann wieder in den inneren Kreis (Rin). Aktivitätsrate: Berechnen Sie die Aktivitätsrate in Prozent, indem Sie die Zeit während der Nahrungssuche bestimmen, wenn die Laufgeschwindigkeit der Fliege 2 mm/s überschreitet. Dieser Parameter spiegelt das Aktivitätsniveau und das Engagement der Fliege bei der Nahrungssuche wider. Es unterscheidet aktive Sammler von weniger aktiven Individuen.HINWEIS: MATLAB und Python wurden in der vorliegenden Studie zur weiteren Analyse der Trajektorien verwendet. Die Skripte können hier abgerufen werden: https://github.com/eagermeagre/sugar_elicited_search. Das Analyseverfahren umfasst die Verwendung der Ctrax-Software, um die Bewegungen der Fliege zu verfolgen und Parameter wie die Dauer der Nahrungssuche, die Gesamtweglänge, die Suchzeit, den Mäander, die Anzahl der Rückkehrer und die Aktivitätsrate zu bestimmen. Diese Parameter liefern wertvolle Einblicke in das Verhalten der Fliege und die Effizienz der Nahrungssuche während der aufgezeichneten Nahrungssuchexperimente.

Representative Results

Die Fliegen mussten für den von der Nahrungshungertoleranz geschätzten Zeitraum ausgehungert werden, und die Reaktion auf Zucker wurde einzeln getestet (Abbildung 1A und Abbildung 2A). Das Verhalten wurde in einem temperatur- und feuchtigkeitskontrollierten Raum aufgezeichnet. Für die berichteten Experimente wurden 0,2 μl 500 mM Saccharoselösung verwendet. Der Zuckertropfen wurde in der Mitte der Arena positioniert und die Fliegen wurden an den Zucker herangeführt (Abbildung 2B). Das Verhalten wurde aufgezeichnet, bis die Fliegen aus der Arena entkamen. Die Videos wurden analysiert, um XY-Koordinaten und Flugbahnen der Fliegen zu extrahieren. Mehrere Parameter wurden verwendet, um die Verhaltensreaktion zu quantifizieren: Pfadlänge, Verweildauer, Mäander, Anzahl der Rückkehrer und Aktivitätsrate. Die Zuckeraufnahme bei ausgehungerten Fliegen führt zu einer lokalen Suche mit einem mäandernden Pfad und Schleifen (Abbildung 3A,C). Als Negativkontrolle wurden ausgehungerte Fliegen erfasst, denen kein Zucker präsentiert wurde8. Diese Fliegen, wenn sie in die Arena eingeführt wurden, leiteten keine Suche ein und entkamen aus der Arena (Abbildung 3B, D). Diese Gruppe wird als ungefütterte Fliegen bezeichnet. Die Parameter der Suche: Pfadlänge, Verweildauer, Mäander und Anzahl der Rückkehrer waren bei ungefütterten Fliegen signifikant niedriger als bei den Fliegen, die einen Zuckertropfen erhielten (Abbildung 4A-D). Abbildung 1: Hungerkurven des Wildtypstamms CS. (A) Hungerkurve, die die Überlebensrate für männliche und weibliche Wildtyp-CS-Fliegen zeigt. (B) Zirkadiane Veränderungen der Fliegensuchaktivitäten zu verschiedenen Tageszeiten. Fehlerbalken stellen S.E.M. (n = 10) dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 2: Versuchsaufbau einschließlich Berechnung der Hungertoleranz, Verhaltensaufzeichnungsverfahren und Trajektorienanalyse. (A) Die Hungertoleranz wurde bestimmt, um einen standardisierten Hungerzustand zu etablieren. Zur Verhaltensaufzeichnung wurden einzelne Fliegen vor dem Experiment in kleinen Röhrchen isoliert. Die Verhaltensarena, eine 90-mm-Petrischale, wurde gleichmäßig von unten beleuchtet. Ein Tropfen Zuckerlösung wurde in die Mitte gegeben und Fliegen erhielten uneingeschränkten Zugang zur Nahrungsquelle. (B) Das Verhalten wurde aufgezeichnet, bis die Fliegen aus der Arena entkamen. Die Videoanalyse verwendete die Ctrax-Software für die Verfolgung und MATLAB/Python für die Trajektorienanalyse. (C) Foto des Versuchsaufbaus. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 3: Notwendigkeit der Zuckeraufnahme für die Einleitung der lokalen Suche. (A) Individuelle Trajektorien von Fliegen, die mit 500 mM, 0,2 μl Zuckerlösung gefüttert wurden. (B) Individuelle Flugbahnen von Fliegen, denen kein Zucker verabreicht wurde. (C) Überlagerung der Suchtrajektorien von Fliegen aus der Kontrollgruppe (n = 11). (D) Überlagerung der Wege der Fliegen (n = 11), denen kein Zucker gegeben wurde. Alle Trajektorien werden auf den Ausgangspunkt des Gehens normalisiert. Diese Abbildung ist eine Adaption von Shakeel und Brockmann8. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 4: Reduktion der Verhaltensparameter bei ungefütterten Fliegen. (A-D) Weglänge, Verweildauer, Mäander und Anzahl der Rückkehrer waren bei hungrigen Fliegen, die keine Zuckerbelohnung erhielten, geringer als bei Kontrollfliegen, die mit Zucker stimuliert wurden. **p < 0,001, ***p < 0,0001, ****p < 0,00001, Wilcoxon-Rangsummentest. Diese Abbildung ist eine Adaption von Shakeel und Brockmann8. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Video 1: Suchverhalten einer Fliege mit Echtzeit-Flugbahn des Pfades. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen. Ergänzende Datei 1: Schrittweise Anleitung zum Verfolgen der Videodatei mit CTRAX. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

Die vorliegende Studie stellt ein einfaches Paradigma zur Untersuchung des durch Zucker ausgelösten Suchverhaltens in Drosophila vor, das erstmals von Dethier2 beschrieben wurde. Dieses angeborene Verhalten ermöglicht es den Fliegen, nach einer Nahrungsbelohnung vor Ort nach zusätzlichen Nahrungsressourcen zu suchen. Der wichtigste Aspekt des Versuchsprotokolls besteht darin, die Fliegen angemessen zu motivieren. Erstens müssen sich die Fliegen in einem Zustand des Hungers befinden, da ihnen die Nahrung entzogen wurde, während sie noch Zugang zu Wasser haben, um die Zuckeraufnahme zu gewährleisten. Um den einheitlichen Hungerzustand über experimentelle Versuche hinweg zu erhalten, wurde die Dauer, in der 90% der Bevölkerung überleben, als Hungerperiode verwendet. Entscheidend ist, dass die Induktion einer Suchreaktion nach der Fütterung die Bereitstellung eines Nahrungsstimulus erfordert, der von ausreichender Qualität ist, aber nicht ausreicht, um die Fliegen vollständig zu sättigen. Daher kann die Standardisierung der Konzentration und Menge an Zucker sowie der Hungerdauer zeitaufwändig sein, ist aber für ein robustes und zuverlässiges Verhalten unerlässlich.

In dieser Studie wurde eine 500 mM, 0,2 μl Saccharoselösung als Stimulus für ausgehungerte Fliegen verwendet. Die Zuckeraufnahme ruft ein charakteristisches lokales Suchverhalten hervor, das durch ein erhöhtes Drehverhalten und häufige Rückkehr zum Ort des Zuckertropfens gekennzeichnet ist (Video 1). Umgekehrt zeigen hungrige Fliegen, die nicht mit Zucker versorgt werden, keine Suchreaktion. Bemerkenswert ist, dass alle verhaltensbezogenen Parameter, einschließlich Pfadlänge, Verweildauer, Mäander und Anzahl der Rückkehrer, bei ungefütterten Fliegen signifikant niedriger waren. Wir haben bereits gezeigt, dass die Aufnahme von Wasser allein keine Suchreaktion hervorruft9.

Dieser Aufbau bietet einen kostengünstigen und wartungsarmen Ansatz zur Untersuchung dieses angeborenen Verhaltens. Während in dieser Studie eine hinterleuchtete Arena verwendet wird, kann auch eine Top-Beleuchtung verwendet werden, solange ein ausreichender Kontrast zwischen der Fliege und dem Hintergrund vorhanden ist. Die verwendete Tracking-Software beruht auf der Erkennung von Fliegenbewegungen vor einem statischen Hintergrund13. Die Kamera- und Auflösungseinstellungen können basierend auf der spezifischen Skala des untersuchten Verhaltens angepasst werden. Wichtig ist, dass diese Methodik die Untersuchung verschiedener Komponenten des Nahrungssuchverhaltens ermöglicht, darunter sensorische Aufmerksamkeit während der Nahrungssuche, Nahrungsaufnahme und -fütterung, Bewegungskontrolle der Suche und Entscheidungsprozesse im Zusammenhang mit Ausbeutung und Erkundung. Darüber hinaus erleichtert dieses Paradigma die Untersuchung der lokalen Suche, ein Verhalten, das häufig bei verschiedenen Taxa in verschiedenen ökologischen Kontexten beobachtet wird6. Die Untersuchung dieses Verhaltens bei Drosophila eröffnet Wege für wissenschaftliche Untersuchungen, die darauf abzielen, die neuronalen Bahnen zu verstehen, die an der Nahrungssuche beteiligt sind. Wir haben die lokale Suche bei Honigbienen untersucht und gezeigt, dass das Verhalten Ähnlichkeit mit Fliegen aufweist 7,8.

Jüngste Studien haben gezeigt, dass lokales Suchverhalten durch optogenetische Aktivierung verschiedener sensorischer Zuckerneuronen bei Fliegen ausgelöst werden kann 14,15,16. Es bleibt jedoch unklar, inwieweit die in diesen Studien beobachteten lokalen Suchen das natürliche Verhalten von Fliegen als Reaktion auf die tatsächliche Zuckeraufnahme genau widerspiegeln. Das Fressverhalten ist bei Fliegen streng reguliert, und diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Aktivierung von pharyngealen Zuckerrezeptoren das Suchverhalten initiiert. Tarsale Geschmackssensillen sind für die Erkennung von Zucker und die Induktion des Rüsselextensionsreflexes verantwortlich, während pharyngeale Geschmacksneuronen bestimmen, ob die Nahrungsaufnahme fortgesetzt werden soll17,18. Nach der Einnahme wandert die Zuckerlösung durch die Speiseröhre zum Proventriculus und gelangt in die Pflanze, wobei ihre Ausdehnung von einem Nervus recurrens überwacht wird19. Darüber hinaus ist es erwähnenswert, dass einige der oben genannten Studien das Einspannen oder Einsperren von Fliegen beinhalteten, während diese Methode es den Tieren ermöglicht, während des gesamten Experiments frei zu laufen. Die Fliegen in unseren Experimenten waren ausreichend motiviert, in der Arena zu bleiben und zu suchen, ohne einen Deckel aufzusetzen.

Das Verständnis des komplizierten Zusammenspiels zwischen neuronalen Bahnen, genetischen Faktoren und Umwelthinweisen, die das Suchverhalten von Fliegen steuern, kann Licht auf die grundlegenden Prinzipien der Informationsverarbeitung, des Lernens und der Gedächtnisbildung werfen. Darüber hinaus wurde eine Dysregulation des Nahrungssuchverhaltens mit verschiedenen menschlichen Störungen in Verbindung gebracht, einschließlich Essstörungen und Fettleibigkeit. Die umfangreiche Palette neurogenetischer Werkzeuge, die in Drosophila zur Verfügung stehen, bietet eine wertvolle Ressource, um das durch Zucker ausgelöste Suchverhalten zu untersuchen und die neuronalen und genetischen Mechanismen zu entschlüsseln, die der Nahrungssuche zugrunde liegen. In Kombination mit optogenetischer Manipulation und funktioneller Bildgebung stellt dieses Paradigma einen leistungsstarken und vielversprechenden Ansatz dar 20,21,22. Die Modifikation des Aufbaus für die Echtzeit-Manipulation neuronaler Aktivität mit Optogenetik könnte jedoch eine Herausforderung darstellen. Um die neuronale Aktivität im Gehirn zu überwachen, während eine Fliege das Suchverhalten ausführt, wird ein anderes Setup benötigt, wie z. B. die angebundene Fliege auf einem Tretball. Viele Aspekte des Nahrungssuchverhaltens, wie z. B. die Regulierung der Nahrungsaufnahme und Entscheidungsprozesse, sind artenübergreifend hochkonserviert. Daher können Erkenntnisse aus der Untersuchung der neuronalen Mechanismen der Nahrungssuche bei Fliegen wertvolle Einblicke in ähnliche Prozesse in anderen Organismen, einschließlich des Menschen, liefern.

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Ravikumar Boyapati für seine Hilfe beim Aufbau der Arena. Diese Arbeit wird durch den Zuschuss der Wellcome Trust DBT Intermediate India Alliance (Fördernummer IA/I/15/2/502074) an P.K. M.S. finanziert. A.B. wurde von institutionellen NCBS-TIFR-Fonds (Nr. 12P4167) und dem Department of Atomic Energy der indischen Regierung (Nr. 12-R& D-TFR-5.04-0800 und 12-R& D-TFR-5.04-0900).

Materials

2 mL Eppendorf tube Sigma Aldrich BR780546 Used to introduce the fly to the sugar drop
Agar SRL 9002-18-0
Azure lens https://www.rmaelectronics.com/azure-photonics-azure-1214mm/
Camera Logicool, Japan
Corn flour locally available
Ctrax software https://ctrax.sourceforge.net/
D-glucose SRL 50-99-7
Flea3 Sony https://www.flir.com/products/flea3-usb3/?vertical=machine+vision&segment=iis
glass tube Borosil Used to house the flies individually 
Kimwipe Kimberly-Clark 34155 Used to provide access to water for flies during food starvation
LED light panel custom-made in the workshop
Light Meter TENMARS   TM-203
Methyl 4-hydroxybenzoate Fisher Scientific 99-76-3
Orthophosphotic acid SRL 7664-38-2 
Petri dish (90 mm) Tarsons 460090
Propionic acid SRL 79-09-4
Sucrose Qualigens Q28105
Sugar locally available
VirtualDub  https://www.virtualdub.org/
White polyvinyl chloride pipe (67 mm inner diameter × 100 mm height) custom-made in the workshop
Yeast powder SRL REF-34266
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参考文献

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Shakeel, M., Kaushik, S., Tanimura, T., Brockmann, A., Kain, P. Tracking Sugar-Elicited Local Searching Behavior in Drosophila. J. Vis. Exp. (201), e65955, doi:10.3791/65955 (2023).
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