JoVE Journal > Medicine
概要
Abstract
Introduction
Protocol
結果
Discussion
開示
Acknowledgements
Materials
参考文献
医学

Secção Automatizada por Vibratomo de Tecido Pulmonar Incorporado em Agarose para Imagem por Fluorescência Multiplex

Published: October 06, 2023
doi:
10.3791/65943
, ,
1Wallenberg Centre for Molecular Medicine,Lund University, 2Department of Clinical Sciences,Lund University, 3Lund Stem Cell Centre,Lund University, 4Department of Cardiothoracic Surgery and Transplantation,Skåne University Hospital

概要

Desenvolvemos uma técnica de processamento tecidual utilizando tecido pulmonar embebido em vibratótomo e agarose para gerar cortes pulmonares, permitindo a aquisição de imagens de alta resolução da arquitetura pulmonar. Empregamos a coloração de imunofluorescência para observar a expressão proteica espacial usando marcadores estruturais pulmonares específicos.

Abstract

Devido à sua fragilidade estrutural inerente, o pulmão é considerado um dos tecidos mais difíceis de processar para leituras microscópicas. Para adicionar suporte estrutural para seccionamento, pedaços de tecido pulmonar são comumente embebidos em parafina ou composto OCT e cortados com micrótomo ou criostato, respectivamente. Uma técnica mais recente, conhecida como cortes pulmonares cortados com precisão, adiciona suporte estrutural ao tecido pulmonar fresco através da infiltração de agarose e fornece uma plataforma para manter o tecido pulmonar primário em cultura. No entanto, devido ao mascaramento de epítopos e à distorção tecidual, nenhuma dessas técnicas se presta adequadamente ao desenvolvimento de leituras avançadas de imagens de luz reprodutíveis que seriam compatíveis entre múltiplos anticorpos e espécies.

Para isso, desenvolvemos um pipeline de processamento de tecidos, que utiliza a incorporação de agarose de tecido pulmonar fixo, acoplado à secção automatizada de vibratomas. Isso facilitou a geração de cortes pulmonares de 200 μm a 70 μm de espessura, em pulmões de camundongos, porcos e humanos, que não requerem recuperação de antígeno e representam a versão menos “processada” do tecido nativo isolado. Usando esses cortes, revelamos uma leitura de imagem multiplex capaz de gerar imagens de alta resolução cuja expressão proteica espacial pode ser usada para quantificar e entender melhor os mecanismos subjacentes à lesão e regeneração pulmonar.

Introduction

Cortes de tecido pulmonar ex vivo são extensivamente utilizados no estudo de doenças pulmonares1. Os padrões ouro atuais, particularmente em estudos clínicos e translacionais com grandes animais, empregam a coloração de hematoxilina e eosina associada à microscopia de campo claro e pontuação baseada em observadores para avaliar e graduar a disfunção pulmonar 2,3. Embora ainda seja uma técnica valiosa, apresenta limitações em termos de resolução espacial e do número de marcadores que podem ser visualizados simultaneamente. Além disso, o tecido pulmonar é submetido a extensas lavagens à base de solventes, o que resulta em desidratação, encolhimento e reidratação do tecido antes de sua imagem final4. Esse processo, além de demorado, é ambientalmente hostil, mascara epítopos proteicos e pode provocar alterações estruturais teciduais 5,6,7,8. No entanto, para o tecido pulmonar, a inclusão em parafina antes da secção tem sido uma necessidade devido à fragilidade estrutural do pulmão. Em contraste, órgãos sólidos, como o cérebro, podem ser cortados por micrótomo vibratório (vibratome), tanto em tecido fixo quanto fresco9,10,11,12.

Para permitir a secção do vibratomo no tecido pulmonar, foi estabelecido um método denominado cortes pulmonares de corte preciso (PCLS), no qual a agarose de baixo ponto de fusão é injetada no tecido pulmonar fresco através das vias aéreas ou vasos sanguíneos e deixada para solidificar13,14. A agarose nas vias aéreas fornece suporte estrutural suficiente para permitir asecção do vibratom9,14. Em roedores, isso é simples de conseguir, pois a agarose pode ser injetada através da traqueia; no entanto, em tecidos suínos e humanos, pode ser um desafio localizar uma via aérea/vaso adequado dentro de uma determinada biópsia15,16. Além disso, mesmo que essa via aérea/vaso esteja localizada, geralmente é necessária força substancial para injetar a agarose, o que pode influenciar a morfologia pulmonar subsequente17.

Para superar os desafios experimentados na incorporação/secção/coloração de parafina e no fluxo de trabalho PCLS, estabelecemos um novo pipeline de processamento para tecido pulmonar fixo. Esse fluxo de trabalho permite o uso de um vibratomo para seccionamento, pode produzir fatias mais finas do que no PCLS e produz fatias que não exigem recuperação de antígeno para imagens de fluorescência multiplex. Este método oferece um meio de “processamento mínimo” para gerar cortes pulmonares que podem ser usados em microscopia de luz avançada. Além disso, leituras de imagens podem ser usadas para demonstrar as relações espaciais das células e estruturas anatômicas dentro do tecido pulmonar, capturando a arquitetura volumétrica do tecido 18,19,20,21. Este trabalho descreve o protocolo para gerar esses cortes pulmonares e demonstra as colorações multiplex aplicadas a cada um desses tecidos e como esses dados avançados de imagem podem ser usados para quantificação.

Protocol

Pulmões de camundongos foram doados por pesquisadores usando outros sistemas de órgãos em um esforço para manter os 3Rs. Todos os procedimentos em suínos foram realizados de acordo com a diretiva europeia 2010/63/EU e foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal de Malmö-Lund (Dnr 5.8.18-05527/2019) e conduzidos de acordo com as diretrizes do CODEX do Conselho de Pesquisa da Suécia. A aprovação para o uso de amostras humanas foi concedida pelo Comitê Nacional de Ética da Suécia (Dnr 2020-07115 e Dnr 2020-01864). Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais e instrumentos utilizados neste protocolo. 1. Preparação de soluções e materiais Fixar o tecido pulmonar em paraformaldeído a 4% à temperatura ambiente durante 48 horas. Em seguida, transferir o tecido pulmonar para um tubo cônico de 50 mL preenchido com solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo azida sódica a 0,01%. Preparar uma solução de agarose a 3% (p/v) dissolvendo 1,5 g de agarose de baixo ponto de fusão em 50 ml de PBS estéril. Prepare um copo plástico, pinça fina e tesoura estéril. Aqueça a agarose no micro-ondas até ferver e, em seguida, arrefeça até 42 °C em banho-maria. Mantenha a agarose em sua forma líquida, armazenando-a em banho-maria até estar pronta para uso.OBS: Ao aquecer a agarose, observe o micro-ondas até que ele comece a ferver para que não transborde. Isso geralmente leva cerca de 1,5 min. 2. Tecido pulmonar embutido em agarose Levantar a biópsia pulmonar da PBS-azida e dissecar cuidadosamente os lobos pulmonares usando pinça fina e tesoura estéril. Corte o lobo pulmonar em blocos menores.NOTA: Embora a secção com pleura seja possível, seus feixes espessos de elastina podem impedir o corte com a lâmina vibratomá. Assim, recomendamos sua remoção se não for necessário. Corte um copo de plástico pelo meio e adicione uma pequena quantidade de agarose ao fundo. Colocar a tampa de um tubo cónico de 50 ml (aro retirado) sobre a superfície da agarose e conservar o copo a 4 °C durante 5 min para permitir que a agarose se solidifique para utilização posterior. Recupere o copo de plástico do frigorífico a 4 °C, adicione aproximadamente 1 ml de agarose líquida à tampa e, em seguida, coloque suavemente o bloco de tecido pulmonar na tampa. Deixe a agarose por 2-3 min para semi-solidificar à temperatura ambiente. Em seguida, despeje lentamente a agarose líquida sobre o tecido pulmonar até que esteja totalmente submersa. Leve à geladeira a 4 °C por aproximadamente 15 min até que a agarose se solidifique. Em seguida, utilizar cuidadosamente uma lâmina afiada para remover agarose extra ao redor do tecido pulmonar, deixando uma camada uniforme de aproximadamente 5 mm de espessura ao redor do tecido (Figura 1). 3. Cortes em tecidos pulmonares Para preparar o tecido pulmonar para secção, fixe cada bloco de tecido no disco da amostra do vibratomo usando super cola. Em seguida, encha a bandeja tampão do vibratomo com PBS e coloque gelo no banho de gelo ao redor. Finalmente, instale cuidadosamente o disco de amostra na bandeja do buffer. Cortar o tecido pulmonar com o vibratomo com as seguintes regulagens: espessura: 200 μm, frequência: 100 Hz, amplitude da lâmina: 1,3 mm e velocidade de avanço da lâmina de 0,02-0,03 mm/s, que depende da rigidez do tecido.NOTA: O corte é possível até uma espessura de 70 μm se a velocidade da lâmina for reduzida para 0,01 mm/s. Certos vibratomes (por exemplo, Leica V1200s) permitem a automação do seccionamento configurando uma janela de corte. Para coletar cortes, transfira suavemente o corte de tecido colhendo-o com um pincel da bandeja de vibratomo para uma placa de 24 poços preenchida com azida a 0,01% em PBS. Finalmente, preservar as fatias de pulmão a 4 °C. 4. Imunomarcação de elastina, CD31, HTII-280 e AME Permeabilizar e bloquear (albumina de soro bovino a 1% + Triton a 0,5% + 5% de soro caprino normal) o tecido a 4 °C sob agitação suave por 45 min. Diluir os anticorpos primários (AME 1:500; elastina 1:250; CD31 1:250; HTII-280 1:250) em PBS, adicionar 300 μL por poço e incubar durante a noite a 4 °C sob agitação suave. Sem tocar no corte e removendo os anticorpos primários com uma ponta de pipeta, lave 3 x 20 min (400 μL) com PBS. Diluir os anticorpos secundários (1:1000) em PBS, adicionar 300 μL por poço e incubar a 4 °C sob agitação suave durante 90 minutos. Remover os anticorpos secundários com uma ponta de pipeta, adicionar 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)(1:1000) e lectina-488 de tomate (1:500) para uma incubação de 30 min e lavar por 3 x 10 min com PBS. Coloque três gotas de meio de montagem no slide, monte uma lamínula e prossiga para a imagem.

Representative Results

O processo de geração de fatias de tecido pulmonar envolve várias etapas principais, incluindo preparação, incorporação e secção. A solução de agarose (3% (p/v) é feita dissolvendo 1,5 g de agarose de baixo ponto de fusão em 50 mL de PBS estéril. Os consumíveis necessários incluem um copo plástico, tampa de um tubo cônico de 50 mL (aro removido), pinça e tesoura. O tecido pulmonar é cuidadosamente ressecado em blocos menores com pinça fina e tesoura estéril (Figura 1A,B). Em seguida, para incorporar os blocos de tecido pulmonar, o fundo do copo é preenchido com uma pequena quantidade de agarose, uma tampa é colocada na superfície da agarose e o copo é armazenado a 4 °C por 5 min (Figura 1C). Aproximadamente 1 mL de agarose líquida é adicionado à pálpebra, e o bloco de tecido pulmonar é colocado sobre a tampa. A agarose é deixada por 2-3 min para semi-solidificar à temperatura ambiente (Figura 1D). Uma vez que um bloco pulmonar é mantido no lugar pela agarose semi-solidificada, agarose líquida é então despejada no copo até que o bloco de tecido pulmonar esteja totalmente submerso. Este é armazenado a 4 °C durante 15 min (Figura 1E,F). A incorporação de agarose de baixo ponto de fusão fornece o suporte e a rigidez necessários ao tecido pulmonar, o que ajuda a manter sua arquitetura original durante o processo de fatiamento. Uma lâmina afiada é usada para remover o excesso de agarose ao redor do tecido pulmonar. Uma camada uniforme de aproximadamente 5 mm de espessura é deixada ao redor do tecido (Figura 1G). O bloco de tecido pulmonar excisado é então cuidadosamente colado no suporte de tecido (Figura 1H). A bandeja tampão do vibratomo é preenchida com PBS, o gelo é colocado no banho de gelo circundante e o disco da amostra instalado na bandeja do tampão (Figura 1I). Os parâmetros de corte do vibratomo fixados no painel foram: espessura de corte: 200 μm; frequência: 100 Hz; amplitude da lâmina: 1.3mm; velocidade de avanço da lâmina: 0,02-0,03 mm/s, que depende da rigidez do tecido (Figura 1J). Finalmente, a coloração é realizada em cortes flutuantes (Figura 1K-M). A coloração por imunofluorescência foi realizada em cortes de 200 μm de cada espécie para actina de músculo liso (SMA, um marcador de célula muscular lisa e miofibroblasto), elastina (proteína da matriz extracelular) e lectina Lycopersicon Esculentum (LEA), que se liga às células epiteliais broncoalveolares. O pulmão é um tecido estruturalmente heterogêneo e, como tal, observa-se distribuição diferencial da AMS e da elastina em todas as estruturas, incluindo ductos alveolares, vasos sanguíneos, bronquíolos intrapulmonares e alvéolos de camundongos, suínos e humanos (Figura 2A-L). Uma renderização de alta resolução de um volume de 20 μm de um bronquíolo mostra como estruturas finas dentro do pulmão podem ser examinadas em um nível semi-tridimensional (Supplemental Video S1). Como exemplo quantitativo, utilizando o traçado de imagens, mostramos como o tamanho dos alvéolos difere entre as amostras (n = 20 alvéolos) (Figura 2L,M). Para mostrar como é possível utilizar quantitativamente esses dados avançados de imagem, comparamos a distribuição de células de pneumócitos tipo 2 (TII) no tecido pulmonar humano de um adulto e um lactente. O anticorpo de células alveolares tipo 2 específico para humanos, HTII-280, tem forte afinidade com a superfície das células humanas tipo 2 (Figura 3A-F). Essas células podem ainda ser visualizadas no espaço tridimensional de um único alvéolo usando imagens volumétricas (Supplemental Video S2). Para quantificar o número de TII entre as amostras de adultos e lactentes, processamos a contagem HTII-280 em 10 campos de visão aleatórios (fov). Entre essas amostras, a amostra de lactentes apresentou contagem de células TII significativamente maior (Figura 3G). No entanto, a amostra infantil também apresentou cobertura de arcabouço significativamente maior que a adulta, o que poderia explicar o maior número de células (Figura 3H). Para isso, avaliou-se, então, o número de ITIs com base na cobertura do arcabouço, como células pormm2 de tecido, que ainda mantinha um número significativamente maior de ITIs na amostra infantil (Figura 3I). Assim, a maior contagem de TII na amostra infantil não se deve ao aumento da cobertura do scafold e ressalta a importância de avaliar a distribuição celular no pulmão com base na área do scaffold, e não no fov global. Figura 1: Protocolo para corte de cortes de tecido pulmonar. (A) As soluções e materiais: uma solução de agarose a 3% (p/v) obtida pela dissolução de 1,5 g de agarose de baixo ponto de fusão em 50 mL de solução salina estéril tamponada com fosfato; um copo plástico; tampa de tubo cônico de 50 mL; fórceps e tesouras. (B) Os tecidos pulmonares foram dissecados com pinça fina e tesoura estéril. (C) Encha o fundo do copo com uma pequena quantidade de agarose e coloque a tampa na superfície da agarose; em seguida, armazená-lo a 4 °C por 5 min. (D) Adicionar lentamente 1-2 mL de agarose líquida à tampa, colocar o pedaço de tecido pulmonar na tampa cuidadosamente e armazená-lo a 4 °C por 2 min. (E,F) Despeje a agarose líquida no copo até que o pedaço de tecido pulmonar esteja totalmente submerso, armazená-lo a 4 °C por 15 min, e, em seguida, quebre o copo de plástico suavemente. (G) Utilizar lâmina pontiaguda para remover o excesso de agarose ao redor do tecido pulmonar, deixando uma camada uniforme de aproximadamente 5 mm de espessura ao redor do tecido. (H) O bloco de tecido pulmonar excisado é então cuidadosamente colado no suporte de tecido. (I) Encha a bandeja tampão do vibratomo com PBS, coloque gelo no banho de gelo ao redor e instale o disco da amostra na bandeja tampão. (J) Definir parâmetros de corte no painel do vibratome; espessura do corte: 200 μm, frequência: 100 Hz, amplitude da faca: 1,3 mm e velocidade de avanço da lâmina de 0,02-0,04 mm/s. (K-M) Imagens representativas de um corte flutuante ainda embutido em agarose e pronto para coloração por imunofluorescência. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: Imagens de imunofluorescência da estrutura pulmonar em humanos, suínos e camundongos. (A-L) Imagens representativas de um ducto alveolar, vaso sanguíneo, bronquíolo e alvéolos em cortes de tecido pulmonar de camundongos, porcos e humanos, respectivamente. A AME (mostrada em verde) é um marcador para células musculares lisas e é observada nas paredes vasculares e brônquicas do tecido pulmonar. A elastina (mostrada em vermelho) faz parte da matriz extracelular dos pulmões. (M) Quantificação do tamanho alveolar selecionando 20 posições aleatórias em cada fatia de tecido pulmonar para amostras humanas, de porcos e camundongos. Histogramas foram utilizados para ilustrar a distribuição do tamanho alveolar dentro de cada grupo. Barras de escala = 50 μm (A-F, H-L), 100 μm (G). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Abreviações: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindol; LEA = lectina Lycopersicon Esculentum; AMS = actina de músculo liso; ms = rato; hmn = humano. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Gráfico 3. Distribuição de pneumócitos tipo 2 em amostras humanas adultas e infantis. (A,B) Imagens representativas de tecido pulmonar humano adulto e infantil corado para HTII-280 (mostrado em vermelho), CD31 (mostrado em verde) e LEA (mostrado em cinza). (C,D) Imagens representativas de humanos adultos e lactentes mostrando apenas a distribuição de pneumócitos tipo 2. (E,F) Imagens representativas de resolução de célula única de um pneumócito tipo 2 individual de amostras de pulmão humano adulto e infantil. (G) Quantificação do número de pneumócitos tipo 2 entre amostras de adultos e lactentes. (H) Quantificação da cobertura da área do arcabouço de tecido pulmonar (% vs ar) em amostras de adultos e lactentes. (I) Quantificação de pneumócitos tipo 2 por mm2 de tecido em amostras de adultos e lactentes. Barras de escala = 5 μm (E,F), 100 μm (A-D). n = 10 fov por amostra. Teste t não pareado ou teste de Mann-Whitney.*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Abreviações: DAPI = 4', 6-diamidino-2-fenilindol; LEA = lectina Lycopersicon Esculentum; HTII = células humanas tipo II; CD31 = molécula de adesão das células endoteliais plaquetárias-1/cluster de diferenciação 31; fov = campo de visão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Vídeo Suplementar S1: Vídeo de 20 μm de volume de imagem de uma única via aérea porcina corada usando DAPI, LEA, AMA e elastina mostrando uma visão de alta resolução da estrutura dos elementos da parede das vias aéreas. Abreviações: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindol; LEA = lectina Lycopersicon Esculentum; AMS = actina de músculo liso. Clique aqui para baixar este arquivo. Vídeo Suplementar S2: Vídeo de 30 μm de volume de imagem de um único alvéolo corado usando DAPI, LA e HTII-280 mostrando a distribuição de pneumócitos tipo 2 em toda a estrutura. Abreviações: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindol; LEA = lectina Lycopersicon Esculentum; AMS = actina de músculo liso. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

Neste protocolo, apresentamos um método aprimorado baseado em vibratomos para geração de cortes pulmonares. Comparado às técnicas de processamento baseadas em parafina, esse método é mais econômico, eficiente em termos de tempo e melhor para o meio ambiente22. Além disso, esse método ajuda a manter a integridade estrutural dos cortes de tecido pulmonar e permite imagens avançadas de imunofluorescência sem a necessidade de recuperação de antígenos. No entanto, durante nossos experimentos, também encontramos certas limitações para esse fluxo de trabalho. Pulmões doentes podem interferir no processo de corte devido à destruição tecidual causada por alterações patológicas. Durante o uso do vibratótomo para seccionamento, obstruções das vias aéreas e tecido pulmonar fibrótico grave podem impedir a lâmina, tornando o processo de corte desses tecidos mais desafiador. No entanto, isso pode ser superado reduzindo a velocidade da lâmina e apoiando o tecido com um pincel fino. Desafios semelhantes surgem do espessamento da pleura, que é um desfecho comum na pleurisia, doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) e fibrose pulmonar idiopática (FPI)23,24,25. Se a pleura não for de interesse para um experimento, recomendamos removê-la antes da secção ou pelo isolamento de um volume pulmonar longe da pleura. Se a pleura for necessária, então ela pode ser fatiada usando uma manipulação semelhante à acima, envolvendo velocidades de lâmina mais lentas e suporte de corte de uma escova fina.

Embora cortes pulmonares cortados com precisão possam preservar a arquitetura tridimensional e o ambiente nativo do pulmão26, é importante notar que a geração de PCIP é um processo complexo e demorado. O sucesso da geração de cortes de tecido pulmonar depende em grande parte da eficiência do enchimento de agarose, que, por sua vez, é influenciado pela presença de pleura intacta e locais viáveis de injeção no tecido obtido. Isso é simples de ser alcançado em roedores, pois a agarose pode ser facilmente introduzida através da traqueia em pulmões intactos27,28,29. No entanto, em grandes pesquisas com animais, as biópsias realizadas em um experimento são tipicamente de segmentos pulmonares distais, que não possuem uma via aérea grande o suficiente para canular30,31. Assim, em vez de injetar agarose no brônquio ou vasos sanguíneos, adotamos este método onde o tecido pulmonar, independentemente da espécie de origem ou volume da amostra, é embutido em agarose de baixo ponto de fusão para gerar cortes de tecido pulmonar. Essa abordagem é tecnicamente mais fácil e visa minimizar ao máximo o dano tecidual. Com base em nossa experiência, este método tem demonstrado maior eficiência e facilidade na geração de cortes de tecido pulmonar. Ele efetivamente preserva a morfologia dos alvéolos e é particularmente adequado para cortar o tecido pulmonar, permitindo a geração de imagens repetitivas de fluorescência multiplex de alta resolução.

Neste estudo, demonstramos ainda duas quantificações baseadas em amostras para os dados de imagem gerados. O primeiro utilizou traçado de imagem para avaliar diferenças no tamanho alveolar entre as amostras de espécies. Sem surpresa, os alvéolos de camundongos foram os menores, enquanto os alvéolos de porco e humanos foram semelhantes em tamanho, destacando os porcos como um modelo translacional interessante para pesquisa pulmonar.

Para a segunda quantificação, comparamos a distribuição do HTII entre uma amostra de pulmão adulto e infantil. Os pneumócitos tipo 2 desempenham um papel vital na estrutura do epitélio pulmonar distal. Essa capacidade única das ITIs contribui para o reparo e regeneração do epitélio alveolar32. No pulmão humano adulto saudável, as ITIs representam aproximadamente 15% da população celular total, enquanto sua cobertura da superfície alveolar é estimada em cerca de 5%33. O HTII-280 é um marcador pulmão-específico amplamente reconhecido para estudar o desenvolvimento e a resposta de células epiteliais alveolares à lesão, e está localizado especificamente nas membranas plasmáticas apicais das ITIs. No experimento, o tecido adulto foi obtido de um paciente doador que morreu devido a hemorragia intracerebral e teve lesão pulmonar concomitante, enquanto a amostra infantil provinha de uma mortalidade relacionada à asfixia. Nossos achados indicam que a expressão do HTII-280 foi significativamente menor na amostra de pulmão adulto do que na amostra infantil. Curiosamente, enquanto o HTII-280 é expresso na maioria das IITs, sua expressão também pode ser influenciada pela qualidade do tecido, sendo significativamente reduzida no tecido pulmonar humano lesado34. Tecidos pulmonares envelhecidos exibem uma diminuição significativa no número e na atividade secretora de ITIs em comparação com tecidos jovens, e indivíduos idosos demonstram proliferação, secreção e atividade antiapoptótica consideravelmente menores de TIIs em comparação com esses tecidos jovens35. Nesse sentido, a identificação e detecção de uma proteína de superfície celular específica para ITIs humanas poderia auxiliar na avaliação da gravidade da lesão pulmonar e na avaliação de condutas terapêuticas que visem melhorar o reparo pulmonar36,37. Assim, utilizando esse pipeline, seria de grande interesse realizar estudos de TII alveolar em coortes humanas maiores de saúde e doença.

Em conclusão, este protocolo apresenta uma abordagem mais rápida e fácil para o corte do tecido pulmonar. Este método fornece instruções detalhadas para a preparação, corte e coloração do tecido pulmonar, garantindo a preservação da estrutura intacta do tecido pulmonar. Ele otimiza o modelo para estudar a arquitetura pulmonar saudável e doente, levando a uma melhor eficiência experimental. Em geral, este estudo introduz uma abordagem promissora para investigar a biologia espacial complexa na fisiopatologia do tecido pulmonar em todas as espécies, o que pode ajudar a entender melhor os mecanismos moleculares em jogo na doença e no reparo.

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores agradecem o financiamento recebido da Wallenberg Molecular Medicine Foundation e do Stem Cell Center da Lund University e reconhecem o Lund University Bioimaging Centre (LBIC) pelo acesso ao Nikon A1RHD.

Materials

24 well tissue culture inserts SARSTEDT 83.3932.300
4% paraformaldehyde SOLVECO 6095714
4’, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Thermo Fisher scientific D1306
50 mL Falcon tube  SARSTEDT 2045221
Cluster of differentiation 31 (CD31) Abcam ab28364
Confocal microscope  Nikon A1R HD25
Elastin Abcam ab23747
Epredia X1000 Coverslip Thermo Fisher scientific 10318963
Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides Thermo Fisher scientific 10149870
Forceps AESCULAP FB395R
Goat anti-mouse 647  Invitrogen  A21235
Goat anti-rabbit 568 Invitrogen  A11011
Human type II cells Terrace Biotech TB-27AHT2-280 
Invitrogen Fluoromount-G Mounting Medium Thermo Fisher scientific E41473
Low gelling temperature Agarose Sigma-Aldrich 1003467046
Lycopersicon Esculentum lectin Thermo Fisher scientific 2531965
Phosphate-buffered saline (PBS) Thermo Fisher scientific 50-100-8798
Plastic cup kontorsgiganten 885221
Scissors STILLE 101-8380-18
Smooth muscle actin Abcam ab5694
Sodium azide Sigma-Aldrich K54329188239
Super glue LOCTITE 2721643
Vibrating microtome Leica VT1200S
DOWNLOAD MATERIALS LIST

参考文献

  1. Morin, J. P., et al. Precision cut lung slices as an efficient tool for in vitro lung physio-pharmacotoxicology studies. Xenobiotica. 43 (1), 63-72 (2013).
  2. Kawasaki, H., et al. The NanoSuit method: a novel histological approach for examining paraffin sections in a nondestructive manner by correlative light and electron microscopy. Laboratory Investigation. 100 (1), 161-173 (2020).
  3. Silva, I., et al. A Semi-quantitative scoring system for green histopathological evaluation of large animal models of acute lung injury. BIO-PROTOCOL. 12 (16), e4493 (2022).
  4. Kim, J. H., et al. Optimizing tissue-clearing conditions based on analysis of the critical factors affecting tissue-clearing procedures. Scientific Reports. 8 (1), 12815 (2018).
  5. Jain, D., et al. Immunocytochemistry for predictive biomarker testing in lung cancer cytology. Cancer Cytopathology. 127 (5), 325-339 (2019).
  6. Alturkistani, H. A., Tashkandi, F. M., Mohammedsaleh, Z. M. Histological stains: a literature review and case study. Global Journal of Health Science. 8 (3), 72-79 (2015).
  7. Morrison, L. E., Lefever, M. R., Lewis, H. N., Kapadia, M. J., Bauer, D. R. Conventional histological and cytological staining with simultaneous immunohistochemistry enabled by invisible chromogens. Laboratory Investigation. 102 (5), 545-553 (2022).
  8. Dineshshankar, J., et al. Kerosene as an alternative to xylene in histopathological tissue processing and staining: An experimental study. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 11 (6), 376 (2019).
  9. Abdelaal, H. M., et al. Comparison of vibratome and compresstome sectioning of fresh primate lymphoid and genital tissues for in situ MHC-tetramer and immunofluorescence staining. Biological Procedures Online. 17 (1), 2 (2015).
  10. Siwczak, F., Hiller, C., Pfannkuche, H., Schneider, M. R. Culture of vibrating microtome tissue slices as a 3D model in biomedical research. Journal of Biological Engineering. 17 (1), 36 (2023).
  11. Bèchet, N. B., Shanbhag, N. C., Lundgaard, I. Glymphatic pathways in the gyrencephalic brain. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 41 (9), 2264-2279 (2021).
  12. Bèchet, N. B., Kylkilahti, T. M., Mattsson, B., Petrasova, M., Shanbhag, N. C., Lundgaard, I. Light sheet fluorescence microscopy of optically cleared brains for studying the glymphatic system. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 40 (10), 1975-1986 (2020).
  13. Bai, Y., Ai, X. Utilizing the precision-cut lung slice to study the contractile regulation of airway and intrapulmonary arterial smooth muscle. Journal of Visualized Experiments. (183), (2022).
  14. Gerckens, M., et al. Generation of human 3D lung tissue cultures (3D-LTCs) for disease modeling. Journal of Visualized Experiments. (144), (2019).
  15. Sanderson, M. J. Exploring lung physiology in health and disease with lung slices. Pulmonary Pharmacology & Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).
  16. Lam, M., Lamanna, E., Organ, L., Donovan, C., Bourke, J. E. Perspectives on precision cut lung slices—powerful tools for investigation of mechanisms and therapeutic targets in lung diseases. Frontiers in Pharmacology. 14, 1162889 (2023).
  17. Liu, G., et al. Use of precision cut lung slices as a translational model for the study of lung biology. Respiratory Research. 20 (1), 162 (2019).
  18. Cooper, P. R., et al. Formoterol and salmeterol induce a similar degree of β 2- adrenoceptor tolerance in human small airways but via different mechanisms. British Journal of Pharmacology. 163 (3), 521-532 (2011).
  19. Ochoa, L. F., et al. Imaging of murine whole lung fibrosis by large scale 3D microscopy aided by tissue optical clearing. Scientific Reports. 8 (1), 13348 (2018).
  20. Tehrani, K. F., Park, J., Chaney, E. J., Tu, H., Boppart, S. A. Nonlinear imaging histopathology: a pipeline to correlate gold-standard hematoxylin and eosin staining with modern nonlinear microscopy. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 29 (4), (2023).
  21. Branchfield, K., et al. A three-dimensional study of alveologenesis in mouse lung. 発生生物学. 409 (2), 429-441 (2016).
  22. Li, Y., et al. Precision vibratome for high-speed ultrathin biotissue cutting and organ-wide imaging. iScience. 24 (9), 103016 (2021).
  23. Qian, G., et al. DOCK2 promotes pleural fibrosis by modulating mesothelial to mesenchymal transition. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 66 (2), 171-182 (2022).
  24. Cagle, P. T., Allen, T. C. Pathology of the pleura: What the pulmonologists need to know. Respirology. 16 (3), 430-438 (2011).
  25. Jantz, M. A., Antony, V. B. Pleural fibrosis. Clinics in Chest Medicine. 27 (2), 181-191 (2006).
  26. Viana, F., O’Kane, C. M., Schroeder, G. N. Precision-cut lung slices: A powerful ex vivo model to investigate respiratory infectious diseases. Molecular Microbiology. 117 (3), 578-588 (2022).
  27. Paddenberg, R., Mermer, P., Goldenberg, A., Kummer, W. Videomorphometric analysis of hypoxic pulmonary vasoconstriction of intra-pulmonary arteries using murine precision cut lung slices. Journal of Visualized Experiments. (83), e50970 (2014).
  28. Lyons-Cohen, M. R., Thomas, S. Y., Cook, D. N., Nakano, H. Precision-cut mouse lung slices to visualize live pulmonary dendritic cells. Journal of Visualized Experiments. (122), e55465 (2017).
  29. Klouda, T., Kim, H., Kim, J., Visner, G., Yuan, K. Precision cut lung slices as an efficient tool for ex vivo pulmonary vessel structure and contractility studies. Journal of Visualized Experiments. (171), e62392 (2021).
  30. Ghaidan, H., et al. Reduction of primary graft dysfunction using cytokine adsorption during organ preservation and after lung transplantation. Nature Communications. 13 (1), 1-15 (2022).
  31. Guenthart, B. A., et al. Regeneration of severely damaged lungs using an interventional cross-circulation platform. Nature Communications. 10 (1), 1985 (1985).
  32. Ruaro, B., et al. The history and mystery of alveolar epithelial type II cells: focus on their physiologic and pathologic role in lung. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2566 (2021).
  33. Crapo, J. D., Barry, B. E., Gehr, P., Bachofen, M., Weibel, E. R. Cell number and cell characteristics of the normal human lung. The American Review of Respiratory Disease. 126 (2), 332-337 (1982).
  34. Evans, K. V., Lee, J. -. H. Alveolar wars: The rise of in vitro models to understand human lung alveolar maintenance, regeneration, and disease. Stem Cells Translational Medicine. 9 (8), 867-881 (2020).
  35. Chen, J. -. X., et al. Sirtuin 3 ameliorates lung senescence and improves type II alveolar epithelial cell function by enhancing the FoxO3a-dependent antioxidant defense mechanism. Stem Cells and Development. 30 (17), 843-855 (2021).
  36. Zacharias, W. J., et al. Regeneration of the lung alveolus by an evolutionarily conserved epithelial progenitor. Nature. 555 (7695), 251-255 (2018).
  37. Gonzalez, R. F., Allen, L., Gonzales, L., Ballard, P. L., Dobbs, L. G. HTII-280, a biomarker specific to the apical plasma membrane of human lung alveolar type II cells. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 58 (10), 891-901 (2010).

タグ

Vibratome SectioningAgarose EmbeddingMultiplex Fluorescence ImagingLarge Animal ModelsSpatial BiologyImmunofluorescenceLight Sheet Fluorescence MicroscopyLung Transplant RejectionSpatial Protein Expression

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
記事を引用
Wang, Q., Bechet, N. B., Lindstedt, S. Automated Vibratome Sectioning of Agarose-Embedded Lung Tissue for Multiplex Fluorescence Imaging. J. Vis. Exp. (200), e65943, doi:10.3791/65943 (2023).
引用ダウンロード
転載と許可

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image