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医学

Sezionamento automatizzato con vibratomo del tessuto polmonare incorporato nell'agarosio per l'imaging a fluorescenza multiplex

Published: October 06, 2023
doi:
10.3791/65943
, ,
1Wallenberg Centre for Molecular Medicine,Lund University, 2Department of Clinical Sciences,Lund University, 3Lund Stem Cell Centre,Lund University, 4Department of Cardiothoracic Surgery and Transplantation,Skåne University Hospital

概要

Abbiamo sviluppato una tecnica di processamento tissutale che utilizza un vibratomo e tessuto polmonare incorporato in agarosio per generare sezioni polmonari, consentendo così l’acquisizione di immagini ad alta risoluzione dell’architettura polmonare. Abbiamo utilizzato la colorazione a immunofluorescenza per osservare l’espressione spaziale delle proteine utilizzando specifici marcatori strutturali polmonari.

Abstract

A causa della sua intrinseca fragilità strutturale, il polmone è considerato uno dei tessuti più difficili da elaborare per le letture microscopiche. Per aggiungere supporto strutturale per il sezionamento, pezzi di tessuto polmonare sono comunemente incorporati in paraffina o composto OCT e tagliati rispettivamente con un microtomo o un criostato. Una tecnica più recente, nota come fette polmonari tagliate con precisione, aggiunge supporto strutturale al tessuto polmonare fresco attraverso l’infiltrazione di agarosio e fornisce una piattaforma per mantenere il tessuto polmonare primario in coltura. Tuttavia, a causa del mascheramento dell’epitopo e della distorsione tissutale, nessuna di queste tecniche si presta adeguatamente allo sviluppo di letture avanzate riproducibili di immagini luminose che sarebbero compatibili con più anticorpi e specie.

A tal fine, abbiamo sviluppato una pipeline di trattamento dei tessuti, che utilizza l’inclusione di agarosio di tessuto polmonare fisso, accoppiato al sezionamento automatizzato del vibratomo. Ciò ha facilitato la generazione di sezioni polmonari da 200 μm a 70 μm di spessore, nei polmoni di topo, maiale e umano, che non richiedono il recupero dell’antigene e rappresentano la versione meno “elaborata” del tessuto nativo isolato. Utilizzando queste sezioni, riveliamo una lettura di imaging multiplex in grado di generare immagini ad alta risoluzione la cui espressione proteica spaziale può essere utilizzata per quantificare e comprendere meglio i meccanismi alla base del danno polmonare e della rigenerazione.

Introduction

Le fette di tessuto polmonare ex vivo sono ampiamente utilizzate nello studio delle malattie polmonari1. Gli attuali gold standard, in particolare negli studi clinici e traslazionali sui grandi animali, impiegano la colorazione con ematossilina ed eosina accoppiata con la microscopia in campo chiaro e il punteggio basato sull’osservatore per valutare e classificare la disfunzione polmonare 2,3. Sebbene sia ancora una tecnica preziosa, presenta limitazioni in termini di risoluzione spaziale e numero di marcatori che possono essere visualizzati contemporaneamente. Inoltre, il tessuto polmonare deve essere sottoposto a ampi lavaggi a base di solventi, che si traducono in disidratazione, restringimento e reidratazione del tessuto prima dell’imaging finale4. Questo processo non solo richiede molto tempo, ma è anche dannoso per l’ambiente, maschera gli epitopi proteici e può invocare cambiamenti strutturalidei tessuti 5,6,7,8. Tuttavia, per il tessuto polmonare, l’inclusione nella paraffina prima del sezionamento è stata una necessità a causa della fragilità strutturale del polmone. Al contrario, organi solidi come il cervello possono essere tagliati utilizzando un microtomo vibrante (vibratomo), sia nel tessuto fisso che in quello fresco 9,10,11,12.

Per consentire il sezionamento del vibratomo nel tessuto polmonare, è stato stabilito un metodo chiamato fette di polmone tagliate di precisione (PCLS) in cui l’agarosio a basso punto di fusione viene iniettato nel tessuto polmonare fresco attraverso le vie aeree o i vasi sanguigni e lasciato solidificare13,14. L’agarosio nelle vie aeree fornisce un supporto strutturale sufficiente per consentire il sezionamento del vibratomo 9,14. Nei roditori, questo è semplice da ottenere poiché l’agarosio può essere iniettato attraverso la trachea; Tuttavia, nei tessuti suini e umani, può essere difficile individuare una via aerea/vaso adatto all’interno di una determinata biopsia15,16. Inoltre, anche se si trova una tale via aerea/vaso, di solito è necessaria una forza notevole per iniettare l’agarosio, che può influenzare la successiva morfologia polmonare17.

Per superare le sfide riscontrate nell’inclusione/sezionamento/colorazione della paraffina e nel flusso di lavoro PCLS, abbiamo stabilito una nuova pipeline di elaborazione per il tessuto polmonare fisso. Questo flusso di lavoro consente l’uso di un vibratomo per il sezionamento, può produrre fette più sottili rispetto alla PCLS e produce fette che non richiedono il recupero dell’antigene per l’imaging a fluorescenza multiplex. Questo metodo offre un mezzo di “minima elaborazione” per generare sezioni polmonari che possono essere utilizzate nella microscopia ottica avanzata. Inoltre, le letture di imaging possono essere utilizzate per dimostrare le relazioni spaziali delle cellule e delle strutture anatomiche all’interno del tessuto polmonare catturando l’architettura volumetrica del tessuto 18,19,20,21. Questo documento descrive il protocollo per generare queste sezioni polmonari e dimostra le colorazioni multiplex applicate a ciascuno di questi tessuti e come questi dati di imaging avanzati possono essere utilizzati per la quantificazione.

Protocol

I polmoni di topo sono stati donati da ricercatori che utilizzano altri sistemi di organi nel tentativo di sostenere le 3R. Tutte le procedure nei suini sono state eseguite in conformità con la direttiva europea 2010/63/UE e sono state approvate dal Comitato etico di Malmö-Lund per la ricerca sugli animali (Dnr 5.8.18-05527/2019) e condotte secondo le linee guida CODEX del Consiglio svedese della ricerca. L’approvazione per l’uso di campioni umani è stata concessa dal Comitato etico nazionale svedese (Dnr 2020-07115 e Dnr 2020-01864). Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali e gli strumenti utilizzati in questo protocollo. 1. Preparazione di soluzioni e materiali Fissare il tessuto polmonare in paraformaldeide al 4% a temperatura ambiente per 48 ore. Successivamente, trasferire il tessuto polmonare in una provetta conica da 50 mL riempita con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) contenente lo 0,01% di sodio azide. Preparare una soluzione di agarosio al 3% (p/v) sciogliendo 1,5 g di agarosio a basso punto di fusione in 50 mL di PBS sterile. Prepara un bicchiere di plastica, una pinza fine e delle forbici sterili. Scaldare l’agarosio nel microonde fino a quando non bolle, quindi raffreddarlo a 42 °C a bagnomaria. Conservare l’agarosio nella sua forma liquida conservandolo a bagnomaria fino al momento dell’uso.NOTA: Mentre si riscalda l’agarosio, guardare il microonde fino a quando non inizia a bollire in modo che non trabocchi. Questo di solito richiede circa 1,5 minuti. 2. Tessuto polmonare incorporato nell’agarosio Sollevare la biopsia polmonare dalla PBS-azide e sezionare accuratamente i lobi polmonari utilizzando una pinza fine e forbici sterili. Tagliare il lobo polmonare in blocchi più piccoli.NOTA: Sebbene sia possibile il sezionamento con pleura, i suoi spessi fasci di elastina possono impedire il taglio con la lama del vibratomo. Pertanto, se non è necessario, se non è necessario, si consiglia la sua rimozione. Taglia un bicchiere di plastica al centro e aggiungi una piccola quantità di agarosio sul fondo. Posizionare il coperchio di una provetta conica da 50 ml (bordo rimosso) sulla superficie dell’agarosio e conservare la coppetta a 4 °C per 5 minuti per consentire all’agarosio di solidificarsi per un uso successivo. Recupera il bicchiere di plastica dal frigorifero a 4 °C, aggiungi circa 1 ml di agarosio liquido sul coperchio, quindi posiziona delicatamente il blocco di tessuto polmonare sul coperchio. Lasciare semisolidificare l’agarosio per 2-3 minuti a temperatura ambiente. Quindi, versare lentamente l’agarosio liquido sul tessuto polmonare fino a quando non è completamente sommerso. Conservare in frigorifero a 4 °C per circa 15 minuti fino a quando l’agarosio non si solidifica. Successivamente, utilizzare con cautela una lama affilata per rimuovere l’agarosio in eccesso che circonda il tessuto polmonare, lasciando uno strato uniforme di circa 5 mm di spessore attorno al tessuto (Figura 1). 3. Taglio di sezioni di tessuto polmonare Per preparare il tessuto polmonare per il sezionamento, fissare ciascun blocco di tessuto sul disco del campione del vibratomo utilizzando la super colla. Quindi, riempire il vassoio del tampone del vibratomo con PBS e posizionare il ghiaccio nel bagno di ghiaccio circostante. Infine, installare con cautela il disco del campione nel vassoio del tampone. Affettare il tessuto polmonare con il vibratomo con le seguenti impostazioni: spessore: 200 μm, frequenza: 100 Hz, ampiezza della lama: 1,3 mm e velocità di avanzamento della lama di 0,02-0,03 mm/s, che dipende dalla rigidità del tessuto.NOTA: Il taglio è possibile fino a uno spessore di 70 μm se la velocità della lama viene ridotta a 0,01 mm/s. Alcuni vibratomi (ad es. Leica V1200s) consentono di automatizzare il sezionamento impostando una finestra di taglio. Per raccogliere le sezioni, trasferire delicatamente la fetta di tessuto raccogliendola con uno spazzolino dal vassoio del vibratomo in una piastra a 24 pozzetti riempita con azide allo 0,01% in PBS. Infine, conservare le fette di polmone a 4 °C. 4. Immunocolorazione di elastina, CD31, HTII-280 e SMA Permeabilizzare e bloccare (1% albumina sierica bovina + 0,5% Tritone + 5% siero caprino normale) il tessuto a 4 °C agitando delicatamente per 45 min. Diluire gli anticorpi primari (SMA 1:500; elastina 1:250; CD31 1:250; HTII-280 1:250) in PBS, aggiungere 300 μL per pozzetto e incubare per una notte a 4 °C con agitazione delicata. Senza toccare la fetta e rimuovendo gli anticorpi primari con un puntale per pipetta, lavare 3 x 20 min (400 μL) con PBS. Diluire gli anticorpi secondari (1:1000) in PBS, aggiungere 300 μL per pozzetto e incubare a 4 °C agitando delicatamente per 90 minuti. Rimuovere gli anticorpi secondari con una punta di pipetta, aggiungere 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) (1:1000) e lectina-488 di pomodoro (1:500) per un’incubazione di 30 minuti e lavare per 3 x 10 minuti con PBS. Posizionare tre gocce di mezzo di montaggio sul vetrino, montare un vetrino coprioggetti e procedere all’imaging.

Representative Results

Il processo di generazione di fette di tessuto polmonare prevede diversi passaggi chiave, tra cui la preparazione, l’inclusione e il sezionamento. La soluzione di agarosio (3% p/v) si ottiene sciogliendo 1,5 g di agarosio a basso punto di fusione in 50 mL di PBS sterile. I materiali di consumo necessari includono un bicchiere di plastica, il coperchio di una provetta conica da 50 ml (bordo rimosso), una pinza e le forbici. Il tessuto polmonare viene accuratamente resecato in blocchi più piccoli con pinze sottili e forbici sterili (Figura 1A,B). Successivamente, per incorporare i blocchi di tessuto polmonare, il fondo della coppetta viene riempito con una piccola quantità di agarosio, viene posto un coperchio sulla superficie dell’agarosio e la coppetta viene conservata a 4 °C per 5 minuti (Figura 1C). Circa 1 ml di agarosio liquido viene aggiunto al coperchio e il blocco di tessuto polmonare viene posizionato sul coperchio. L’agarosio viene lasciato semisolidificare per 2-3 minuti a temperatura ambiente (Figura 1D). Una volta che un blocco polmonare è tenuto in posizione dall’agarosio semisolidificato, l’agarosio liquido viene quindi versato nella tazza fino a quando il blocco di tessuto polmonare non è completamente sommerso. Questo viene conservato a 4 °C per 15 minuti (Figura 1E,F). L’inclusione di agarosio a basso punto di fusione fornisce il supporto e la rigidità necessari al tessuto polmonare, che aiuta a mantenere la sua architettura originale durante il processo di affettatura. Una lama affilata viene utilizzata per rimuovere l’agarosio in eccesso che circonda il tessuto polmonare. Uno strato uniforme di circa 5 mm di spessore viene lasciato intorno al tessuto (Figura 1G). Il blocco di tessuto polmonare asportato viene quindi accuratamente incollato sul supporto del tessuto (Figura 1H). Il vassoio del tampone del vibratomo viene riempito con PBS, il ghiaccio viene posizionato nel bagno di ghiaccio circostante e il disco del campione viene installato nel vassoio del tampone (Figura 1I). I parametri di taglio del vibratomo impostati sul pannello erano: spessore fetta: 200 μm; frequenza: 100 Hz; ampiezza della lama: 1,3 mm; velocità di avanzamento della lama: 0,02-0,03 mm/s, che dipende dalla rigidità del tessuto (Figura 1J). Infine, la colorazione viene effettuata su fette flottanti (Figura 1K-M). La colorazione a immunofluorescenza è stata effettuata in sezioni di 200 μm di ciascuna specie per l’actina della muscolatura liscia (SMA, una cellula muscolare liscia e marcatore miofibroblastico), l’elastina (proteina della matrice extracellulare) e la lectina di Lycopersicon Esculentum (LEA), che si lega alle cellule epiteliali broncoalveolari. Il polmone è un tessuto strutturalmente eterogeneo e, come tale, la distribuzione differenziale di SMA ed elastina si osserva tra le strutture, compresi i dotti alveolari, i vasi sanguigni, i bronchioli intrapolmonari e gli alveoli di topi, maiali e esseri umani (Figura 2A-L). Un rendering ad alta risoluzione di un volume di 20 μm di un bronchiolo mostra come le strutture fini all’interno del polmone possano essere esaminate a livello semi-tridimensionale (Video supplementare S1). Come esempio quantitativo, utilizzando il tracciamento delle immagini, mostriamo come la dimensione degli alveoli differisca tra i campioni (n = 20 alveoli) (Figura 2L,M). Per mostrare come sia possibile utilizzare quantitativamente questi dati di imaging avanzati, abbiamo confrontato le distribuzioni delle cellule di pneumociti di tipo 2 (TII) nel tessuto polmonare umano di un adulto e di un bambino. L’anticorpo a cellule alveolari di tipo 2 specifico per l’uomo, HTII-280, ha una forte affinità con la superficie delle cellule umane di tipo 2 (Figura 3A-F). Queste cellule possono inoltre essere visualizzate nello spazio tridimensionale di un singolo alveolo utilizzando l’imaging volumetrico (Supplemental Video S2). Per quantificare il numero di TII tra i campioni di adulti e neonati, abbiamo elaborato il conteggio HTII-280 su 10 campi visivi casuali (fov). Tra questi campioni, il campione neonato ha prodotto un numero di cellule TII significativamente più alto (Figura 3G). Tuttavia, il campione neonato ha anche mostrato una copertura dell’impalcatura significativamente più elevata rispetto all’adulto, il che potrebbe spiegare il numero di cellule più elevato (Figura 3H). Per tenere conto di ciò, abbiamo quindi valutato il numero di TII in base alla copertura dello scaffold, come cellule per mm2 di tessuto, che ha mantenuto un numero significativamente più alto di TII nel campione infantile (Figura 3I). Pertanto, la più alta conta di TII nel campione neonato non è dovuta a una maggiore copertura dello scaffold ed evidenzia l’importanza di valutare la distribuzione delle cellule nel polmone in base all’area dell’impalcatura, non al fov complessivo. Figura 1: Protocollo per il taglio di fette di tessuto polmonare. (A) Le soluzioni e i materiali: una soluzione di agarosio al 3% (p/v) ottenuta sciogliendo 1,5 g di agarosio a basso punto di fusione in 50 mL di soluzione fisiologica sterile tamponata con fosfato; un bicchiere di plastica; un coperchio da una provetta conica da 50 ml; pinze e forbici. (B) I tessuti polmonari sono stati sezionati utilizzando pinze sottili e forbici sterili. (C) Riempire il fondo della tazza con una piccola quantità di agarosio e posizionare il coperchio sulla superficie dell’agarosio; quindi conservare a 4 °C per 5 min. (D) Aggiungere lentamente 1-2 ml di agarosio liquido al coperchio, posizionare con cura il pezzo di tessuto polmonare sul coperchio e conservarlo a 4 °C per 2 min. (E,F) Versare l’agarosio liquido nella tazza fino a quando il pezzo di tessuto polmonare non è completamente sommerso, conservarlo a 4 °C per 15 min, e poi rompere delicatamente il bicchiere di plastica. (G) Utilizzare una lama affilata per rimuovere l’agarosio in eccesso che circonda il tessuto polmonare, lasciando uno strato uniforme di circa 5 mm di spessore intorno al tessuto. (H) Il blocco di tessuto polmonare asportato viene quindi accuratamente incollato sul supporto del tessuto. (I) Riempire il vassoio del tampone del vibratomo con PBS, posizionare il ghiaccio nel bagno di ghiaccio circostante e installare il disco del campione nel vassoio del tampone. (J) Impostare i parametri di taglio sul pannello del vibratomo; spessore della fetta: 200 μm, frequenza: 100 Hz, ampiezza del coltello: 1,3 mm e velocità di avanzamento della lama di 0,02-0,04 mm/s. (K-M) Immagini rappresentative di una fetta fluttuante ancora incorporata nell’agarosio e pronta per la colorazione in immunofluorescenza. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: Immagini in immunofluorescenza della struttura polmonare nell’uomo, nel maiale e nel topo. (A-L) Immagini rappresentative di un dotto alveolare, di un vaso sanguigno, di un bronchiolo e di alveoli in fette di tessuto polmonare rispettivamente di topo, maiale e uomo. La SMA (mostrata in verde) è un marcatore per le cellule muscolari lisce e si osserva nelle pareti vascolari e bronchiali del tessuto polmonare. L’elastina (mostrata in rosso) fa parte della matrice extracellulare dei polmoni. (M) Quantificazione delle dimensioni alveolari selezionando 20 posizioni casuali su ciascuna fetta di tessuto polmonare per campioni umani, suini e topi. Gli istogrammi sono stati utilizzati per illustrare la distribuzione delle dimensioni alveolari all’interno di ciascun gruppo. Barre di scala = 50 μm (A-F, H-L), 100 μm (G). Test di Kruskall-Wallis. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Abbreviazioni: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindolo; LEA = Lycopersicon Esculentum lectin; SMA = actina della muscolatura liscia; ms = mouse; HMN = umano. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3. Distribuzione degli pneumociti di tipo 2 in campioni umani, adulti e neonati. (A,B) Immagini rappresentative del tessuto polmonare umano adulto e infantile colorato per HTII-280 (mostrato in rosso), CD31 (mostrato in verde) e LEA (mostrato in grigio). (C,D) Immagini rappresentative di esseri umani adulti e neonati che mostrano solo la distribuzione degli pneumociti di tipo 2. (E,F) Immagini rappresentative a risoluzione cellulare singola di un singolo pneumocita di tipo 2 da campioni polmonari umani adulti e neonati. (G) Quantificazione del numero di pneumociti di tipo 2 tra campioni adulti e neonati. (H) Quantificazione della copertura dell’area dell’impalcatura del tessuto polmonare (% vs aria) in campioni di adulti e neonati. (I) Quantificazione dello pneumocita di tipo 2 per mm2 di tessuto in campioni di adulti e neonati. Barre di scala = 5 μm (E,F), 100 μm (A-D). n = 10 FOV per campione. Test t spaiato o test di Mann-Whitney. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Abbreviazioni: DAPI = 4', 6-diamidino-2-fenilindolo; LEA = Lycopersicon Esculentum lectin; HTII = cellule umane di tipo II; CD31 = molecola di adesione delle cellule endoteliali piastriniche-1/cluster di differenziazione 31; FOV = Campo visivo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Video supplementare S1: Video di un volume di imaging di 20 μm di una singola via aerea suina colorata con DAPI, LEA, SMA ed elastina che mostra una vista ad alta risoluzione della struttura degli elementi della parete delle vie aeree. Abbreviazioni: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindolo; LEA = Lycopersicon Esculentum lectin; SMA = actina della muscolatura liscia. Fare clic qui per scaricare il file. Video supplementare S2: Video di un volume di imaging di 30 μm di un singolo alveolo colorato con DAPI, LEA e HTII-280 che mostra la distribuzione degli pneumociti di tipo 2 attraverso la struttura. Abbreviazioni: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindolo; LEA = Lycopersicon Esculentum lectin; SMA = actina della muscolatura liscia. Fare clic qui per scaricare il file.

Discussion

In questo protocollo, presentiamo un metodo migliorato basato sul vibratomo per generare sezioni polmonari. Rispetto alle tecniche di lavorazione basate sulla paraffina, questo metodo è più conveniente, efficiente in termini di tempo e migliore per l’ambiente22. Inoltre, questo metodo aiuta a mantenere l’integrità strutturale delle fette di tessuto polmonare e consente l’imaging avanzato in immunofluorescenza senza la necessità di recuperare l’antigene. Tuttavia, durante i nostri esperimenti, abbiamo anche riscontrato alcune limitazioni a questo flusso di lavoro. I polmoni malati possono interferire con il processo di taglio a causa della distruzione dei tessuti causata da cambiamenti patologici. Durante l’utilizzo del vibratomo per il sezionamento, le ostruzioni delle vie aeree e il tessuto polmonare fibrotico grave possono ostacolare la lama, rendendo più impegnativo il processo di taglio di questi tessuti. Tuttavia, questo può essere superato riducendo la velocità della lama e sostenendo il tessuto con un pennello fine. Sfide simili derivano dall’ispessimento della pleura, che è un esito comune nella pleurite, nella broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO) e nella fibrosi polmonare idiopatica (IPF)23,24,25. Se la pleura non è di interesse per un esperimento, si consiglia di rimuoverla prima del sezionamento o di isolarla a un volume polmonare di distanza dalla pleura. Se la pleura è necessaria, può essere affettata utilizzando una manipolazione simile a quella di cui sopra, che comporta velocità della lama più lente e supporto della fetta da un pennello fine.

Sebbene le fette di polmone tagliate con precisione possano preservare l’architettura tridimensionale e l’ambiente nativo del polmone26, è importante notare che la generazione di PCLS è un processo complesso e dispendioso in termini di tempo. Il successo della generazione di fette di tessuto polmonare dipende in gran parte dall’efficienza del riempimento con agarosio, che, a sua volta, è influenzato dalla presenza di pleura intatta e siti di iniezione vitali nel tessuto ottenuto. Questo è semplice da ottenere nei roditori poiché l’agarosio può essere facilmente introdotto attraverso la trachea nei polmoni intatti27,28,29. Tuttavia, nella ricerca su animali di grandi dimensioni, le biopsie prelevate in un esperimento provengono in genere da segmenti polmonari distali, che mancano di una via aerea sufficientemente grande per incannulare30,31. Pertanto, invece di iniettare agarosio nel bronco o nei vasi sanguigni, adottiamo questo metodo in cui il tessuto polmonare, indipendentemente dalla specie di origine o dal volume del campione, è incorporato in agarosio a basso punto di fusione per generare fette di tessuto polmonare. Questo approccio è tecnicamente più semplice e mira a ridurre il più possibile il danno tissutale. Sulla base della nostra esperienza, questo metodo ha dimostrato una maggiore efficienza e facilità nella generazione di sezioni di tessuto polmonare. Preserva efficacemente la morfologia degli alveoli ed è particolarmente adatto per il taglio del tessuto polmonare, consentendo la generazione di imaging a fluorescenza multiplex ripetibile ad alta risoluzione.

In questo studio, dimostriamo ulteriormente due quantificazioni basate su campioni per i dati di imaging generati. Il primo ha utilizzato il tracciamento delle immagini per valutare le differenze nelle dimensioni alveolari tra i campioni di specie. Non sorprende che gli alveoli di topo fossero i più piccoli, mentre gli alveoli di maiale e umani erano di dimensioni simili, evidenziando i maiali come un interessante modello traslazionale per la ricerca polmonare.

Per la seconda quantificazione, abbiamo confrontato la distribuzione dell’HTII tra un campione polmonare adulto e infantile. Gli pneumociti di tipo 2 svolgono un ruolo fondamentale nella struttura dell’epitelio polmonare distale. Questa capacità unica dei TII contribuisce alla riparazione e alla rigenerazione dell’epitelio alveolare32. Nel polmone umano adulto sano, i TII rappresentano circa il 15% della popolazione cellulare totale, mentre la loro copertura della superficie alveolare è stimata intorno al 5%33. HTII-280 è un marcatore polmonare specifico ampiamente riconosciuto per lo studio dello sviluppo e della risposta delle cellule epiteliali alveolari alle lesioni ed è specificamente localizzato alle membrane plasmatiche apicali dei TII. Nell’esperimento, il tessuto adulto è stato ottenuto da un paziente donatore deceduto a causa di un’emorragia intracerebrale e con lesioni polmonari concomitanti, mentre il campione infantile proveniva da una mortalità correlata all’asfissia. I nostri risultati indicano che l’espressione di HTII-280 era significativamente più bassa nel campione polmonare adulto rispetto al campione infantile. È interessante notare che, mentre HTII-280 è espresso nella maggior parte degli HTII, la sua espressione può anche essere influenzata dalla qualità dei tessuti ed è significativamente ridotta nel tessuto polmonare umano danneggiato34. I tessuti polmonari invecchiati mostrano una significativa diminuzione del numero e dell’attività secretoria dei TII rispetto ai tessuti giovani e gli individui anziani dimostrano una proliferazione, una secrezione e un’attività anti-apoptotica dei TII notevolmente inferiori rispetto a quei tessuti giovani35. In linea con questo, l’identificazione e il rilevamento di una proteina di superficie cellulare specifica per i TII umani potrebbe aiutare a valutare la gravità del danno polmonare e a valutare gli approcci terapeutici volti a migliorare la riparazione polmonare36,37. Pertanto, utilizzando questa pipeline, sarebbe di grande interesse condurre studi di TII alveolare in coorti umane più ampie di salute e malattia.

In conclusione, questo protocollo presenta un approccio più rapido e semplice per il taglio del tessuto polmonare. Questo metodo fornisce istruzioni dettagliate per la preparazione, il taglio e la colorazione del tessuto polmonare, garantendo la conservazione della struttura intatta del tessuto polmonare. Ottimizza il modello per lo studio dell’architettura polmonare sia sana che malata, portando a una migliore efficienza sperimentale. Nel complesso, questo studio introduce un approccio promettente per studiare la complessa biologia spaziale nella fisiopatologia del tessuto polmonare tra le specie, che può aiutare a comprendere meglio i meccanismi molecolari in gioco nella malattia e nella riparazione.

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori ringraziano i finanziamenti ricevuti dalla Wallenberg Molecular Medicine Foundation e dal Stem Cell Center dell’Università di Lund e ringraziano il Lund University Bioimaging Centre (LBIC) per l’accesso alla Nikon A1RHD.

Materials

24 well tissue culture inserts SARSTEDT 83.3932.300
4% paraformaldehyde SOLVECO 6095714
4’, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Thermo Fisher scientific D1306
50 mL Falcon tube  SARSTEDT 2045221
Cluster of differentiation 31 (CD31) Abcam ab28364
Confocal microscope  Nikon A1R HD25
Elastin Abcam ab23747
Epredia X1000 Coverslip Thermo Fisher scientific 10318963
Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides Thermo Fisher scientific 10149870
Forceps AESCULAP FB395R
Goat anti-mouse 647  Invitrogen  A21235
Goat anti-rabbit 568 Invitrogen  A11011
Human type II cells Terrace Biotech TB-27AHT2-280 
Invitrogen Fluoromount-G Mounting Medium Thermo Fisher scientific E41473
Low gelling temperature Agarose Sigma-Aldrich 1003467046
Lycopersicon Esculentum lectin Thermo Fisher scientific 2531965
Phosphate-buffered saline (PBS) Thermo Fisher scientific 50-100-8798
Plastic cup kontorsgiganten 885221
Scissors STILLE 101-8380-18
Smooth muscle actin Abcam ab5694
Sodium azide Sigma-Aldrich K54329188239
Super glue LOCTITE 2721643
Vibrating microtome Leica VT1200S
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参考文献

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Wang, Q., Bechet, N. B., Lindstedt, S. Automated Vibratome Sectioning of Agarose-Embedded Lung Tissue for Multiplex Fluorescence Imaging. J. Vis. Exp. (200), e65943, doi:10.3791/65943 (2023).
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