JoVE Journal > Neuroscience
概要
Abstract
Introduction
Protocol
結果
Discussion
開示
Acknowledgements
Materials
参考文献
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
神経科学

신경 질환을 모델링하고 치료적으로 표적화하기 위한 체외 혈액-뇌 장벽 재건

Published: October 20, 2023
doi:
10.3791/65921
, , , , , , ,
1Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Black Family Stem Cell Institute at Mount Sinai, 3Ronald M. Loeb Center for Alzheimer’s Disease at Mount Sinai, 4Friedman Brain Institute at Mount Sinai, 5Nash Family Department of Neuroscience at Mount Sinai

概要

혈액뇌장벽(BBB)은 안정적이고 건강한 뇌 환경을 유지하는 데 중요한 역할을 합니다. BBB 기능 장애는 많은 신경 질환과 관련이 있습니다. 우리는 뇌혈관 병리, BBB 무결성, BBB가 유전학 및 질병에 의해 어떻게 변형되는지 조사하기 위해 BBB의 3D 줄기세포 유래 모델을 개발했습니다.

Abstract

혈액뇌장벽(BBB)은 중추신경계(CNS)의 핵심 생리학적 구성 요소로, 영양분을 유지하고 노폐물을 제거하며 병원균으로부터 뇌를 보호합니다. BBB의 고유한 장벽 특성은 신경 질환을 치료하기 위해 CNS로의 치료 약물 전달에 어려움을 제기합니다. BBB 기능 장애는 신경 질환과 관련이 있습니다. 대뇌 아밀로이드 혈관병증(CAA)은 대뇌 혈관에 아밀로이드가 침착되어 BBB가 손상되는 현상으로, 알츠하이머병(AD)의 대부분의 경우 동반 질환으로, BBB 기능 장애 또는 고장이 신경 퇴행에 관여할 수 있음을 시사합니다. 인간 BBB 조직에 대한 접근이 제한되어 있기 때문에 적절한 BBB 기능과 BBB 변성에 기여하는 메커니즘은 아직 알려져 있지 않습니다. 이러한 한계를 해결하기 위해 내피 세포, 주위 세포 및 성상세포를 3D 매트릭스에 통합하여 인간 만능 줄기 세포 유래 BBB(iBBB)를 개발했습니다. iBBB는 BBB에 존재하는 해부학적 구조와 세포 상호 작용을 요약하기 위해 자체 조립됩니다. iBBB에 아밀로이드를 파종하면 CAA의 주요 측면을 포착할 수 있습니다. 또한 iBBB는 뇌혈관 질환 및 신경 퇴행과 관련된 유전적 및 환경적 요인을 조절하여 유전학 및 생활 방식이 질병 위험에 미치는 영향을 조사할 수 있는 유연한 플랫폼을 제공합니다. 마지막으로, iBBB는 중추신경계에 대한 치료 전달을 최적화하기 위해 약물 스크리닝 및 의약 화학 연구에 사용할 수 있습니다. 본 프로토콜에서는 인간 만능줄기세포에서 발생하는 3가지 유형의 세포(내피세포, 주위세포, 성상교세포)의 분화, 분화된 세포를 iBBB로 조립하는 방법, 외인성 아밀로이드를 이용하여 in vitro 에서 CAA를 모델링하는 방법에 대해 설명합니다. 이 모델은 생물학적 충실도와 실험적 유연성을 모두 갖춘 시스템으로 살아있는 인간 뇌 조직을 연구하는 문제를 극복하고 인간 BBB와 신경 퇴행에서의 역할을 조사할 수 있습니다.

Introduction

혈액뇌장벽(BBB)은 중추신경계(CNS)를 말초에서 분리하여 적절한 신경 기능을 위한 이상적인 환경을 유지하는 핵심 미세혈관 네트워크입니다. 뇌는 대사 항상성 1,2,3,4를 유지하고, 노폐물 4,5,6을 제거하며, 병원균과 독소로부터 뇌를 보호함으로써 중추신경계로의 물질 유입과 유출을 조절하는 데 중요한 역할을 합니다 7,8.

BBB의 일차 세포 유형은 내피 세포(EC)입니다. 중배엽 계통에서 유래 한 내피 세포는 혈관 (vasculature) 1,9의 벽을 형성합니다. 미세혈관 EC는 서로 긴밀한 접합부를 형성하여 막의 투과성을 크게 감소시키는 동시에10,11,12,13,14 중추신경계 1,4,12,14 안팎으로 영양소의 이동을 촉진하는 수송체를 발현합니다. 미세혈관 EC는 미세혈관 기능과 항상성을 조절하는 주위 세포(PC)-벽화 세포로 둘러싸여 있으며 분자 및 면역 세포에 대한 BBB의 투과성을 조절하는 데 중요합니다 15,16,17. 주요 신경교세포(glial cell) 유형인 성상교세포(astrocyte)는 BBB를 구성하는 최종 세포 유형입니다. 성상세포(astrocyte)의 말단은 EC-PC 혈관관을 감싸고 세포체는 뇌 실질(brain parenchyma)로 확장되어 뉴런과 혈관 1 사이의 연결을 형성합니다. 뚜렷한 용질 및 기질 수송체는 BBB 기능 18,19,20,21에서 중요한 역할을 하는 성상세포(astrocyte) 말단부(예를 들어, 아쿠아포린 4[AQP-4])에 국한된다.

BBB는 적절한 뇌 건강 기능을 유지하는 데 중요하며, BBB의 기능 장애는 알츠하이머병(AD)22,23,24,25, 다발성 경화증 7,26,27,28, 간질29,30 및 뇌졸중 31,32을 포함한 많은 신경 질환에서 보고되었습니다. 뇌혈관 이상이 신경 퇴행의 중심적인 역할을 하여 허혈성 및 출혈성 사건에 대한 감수성을 증가시키는 데 기여한다는 사실이 점점 더 인식되고 있습니다. 예를 들어, 알츠하이머병 환자의 90% 이상이 뇌혈관을 따라 아밀로이드 β(Aβ)이 침착되는 것을 특징으로 하는 뇌 아밀로이드 혈관병증(CAA)을 앓고 있습니다. CAA는 BBB 투과성을 증가시키고 BBB 기능을 감소시켜 중추신경계를 허혈, 출혈성 사건 및 가속화된 인지 기능 저하에 취약하게 만든다33.

우리는 최근 3D 매트릭스에 캡슐화된 EC, PC 및 성상세포를 통합하는 환자 유도 만능 줄기세포에서 파생된 인간 BBB의 시험관 내 모델을 개발했습니다(그림 1A). iBBB는 혈관관 형성 및 혈관 구조와 성상세포 말단의 위치 파악을 포함하여 생리학적으로 관련된 상호작용을 재현한다24. iBBB를 적용하여 APOE4에 의해 매개되는 CAA의 감수성을 모델링했습니다(그림 1B). 이를 통해 APOE4가 CAA를 촉진하는 인과적 세포 및 분자 메커니즘을 식별하고, 이러한 통찰력을 활용하여 APOE4 마우스24에서 CAA 병리를 줄이고 생체 내 학습 및 기억을 개선하는 치료 전략을 개발할 수 있었습니다. 여기에서는 인간 iPSC에서 BBB를 재구성하고 체외에서 CAA를 모델링하기 위한 자세한 프로토콜과 비디오 자습서를 제공합니다.

Protocol

1. iPSC를 iBBB 세포로 분화 참고: 이러한 차별화 프로토콜은 이전에 Mesentier-Louro et al.34에서 설명되었습니다. 코팅 세포 배양 플레이트감소된 성장 인자(GF) 막 매트릭스를 4°C에서 밤새 해동합니다. 500μL의 기저막 매트릭스를 49.5mL의 DMEM에 희석합니다. 코팅 용액의 조기 중합을 방지하기 위해 이 용액을 차갑게 유지하십시오. 6…

Representative Results

적절하게 형성된 iBBB는 하나의 반투명 디스크로 응고됩니다(그림 3A). iBBB가 며칠 후에 처음 피펫팅된 표면에서 분리되는 것은 정상입니다. 이것은 피할 수 없지만 실수로 iBBB를 흡입하지 않도록 매체를 교체할 때 주의를 기울인다면 iBBB의 적절한 형성에 큰 문제가 되지 않습니다. 24시간 후 균일하게 분포된 단일 세포를 명시야 현미경으로 식별할 수 있습니다(…

Discussion

BBB 기능 장애는 동반 질환이며, 잠재적으로 수많은 신경 질환의 원인 또는 악화 요인이 될 수 있다 7,40,41. 그러나 신경 혈관 질환이 있는 인간에서 BBB의 기능 장애 및 고장의 기저에 있는 분자 및 세포 생물학을 연구하는 것은 거의 불가능합니다. 이 프로토콜에 제시된 유도 BBB(iBBB)는 혈관관 형성 및 혈관 구조와 성상세포 말단?…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 연구는 NIH 3-UG3-NS115064-01, R01NS14239, Cure Alzheimer’s Fund, NASA 80ARCO22CA004, Chan-Zuckerberg Initiative, MJFF/ASAP Foundation 및 Brain Injury Association of America의 지원을 받습니다. C.G.는 NIH F31NS130909의 지원을 받습니다. 그림 1A 는 BioRender.com 로 만들어졌습니다.

Materials

6e10 amyloid-β antibody Biolegend SIG-39320 Used at 1:1000
Accutase Innovative Cell Technologies AT104
Activin A Peprotech 20-14E
Alexa Fluor 488, 555, 647 secondary antibodies Invitrogen Various Used at 1:1000
Amyloid-beta 40 fibril AnaSpec AS-24235
Amyloid-beta 42 fibril AnaSpec AS-20276
Aquaporin-4 antibody Invitrogen PA5-53234 Used at 1:300
Astrocyte basal media and supplements ScienCell 1801
B-27 serum-free supplement Gibco 17504044
BMP4 Peprotech 120-05ET
CHIR99021 Cyamn Chemical 13112
DMEM/F12 with GlutaMAX medium Gibco 10565018
Doxycycline Millipore-Sigma D3072-1ML
FGF-basic Peprotech 100-18B
Fluoromount-G slide mounting medium VWR 100502-406
Forskolin R&D Systems 1099/10
GeltrexTM LDEV-Free hESC-qualified Reduced Growth Factor Basement  Gibco A1413302
Glass Bottom 48-well Culture Dishes Mattek Corporation P48G-1.5-6-F
GlutaMAX supplement Gibco 35050061
Hoechst 33342  Invitrogen H3570
Human Endothelial Serum-free medium Gibco 11111044
LDN193189 Tocris 6053
Minimum Essential Medium Non-essential Amino Acid Solution (MEM-NEAA)  Gibco 11140050
N-2 supplement Gibco 17502048
Neurobasal medium Gibco 21103049
Normal Donkey Serum Millipore-Sigma S30-100mL Use serum to match secondary antibody host
Paraformaldehyde (PFA)  ThermoFisher 28908
PDGF-BB Peprotech 100-14B
PDGFRB (Platelet-derived growth factor receptor beta) antibody R&D Systems AF385 Used at 1:500
Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 Gibco 10010031
Pecam1 (Platelet endothelial cell adhesion molecule 1) antibody R&D Systems AF806 Used at 1:500
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
PiggyBac plasmid (PB_iETV2_P2A_GFP_Puro) AddGene  Catalog #168805
S100B antibody Sigma-Aldrich S2532-100uL Used at 1:500
SB43152 Reprocell 04-0010
Thioflavin T Chem Impex 22870 Used at 25uM
Triton X-100  Sigma-Aldrich T8787-250mL
VE-cadherin (CD144) antibody R&D systems AF938 Used at 1:500
VEGF-A Peprotech 100-20
Y27632 R&D Systems 1254/10
ZO-1 Invitrogen MA3-39100-A488 Dilution = 1:500
DOWNLOAD MATERIALS LIST

参考文献

  1. Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), a020412 (2015).
  2. Segarra, M., Aburto, M. R., Acker-Palmer, A. Blood-brain barrier dynamics to maintain brain homeostasis. Trends in Neurosciences. 44 (5), 393-405 (2021).
  3. Campos-Bedolla, P., Walter, F. R., Veszelka, S., Deli, M. A. Role of the blood-brain barrier in the nutrition of the central nervous system. Archives of Medical Research. 45 (8), 610-638 (2014).
  4. Hladky, S. B., Barrand, M. A. Fluid and ion transfer across the blood-brain and blood-cerebrospinal fluid barriers; a comparative account of mechanisms and roles. Fluids and Barriers of the CNS. 13 (1), 19 (2016).
  5. Kaur, J., et al. Waste clearance in the brain. Frontiers in Neuroanatomy. 15, 665803 (2021).
  6. Verheggen, I. C. M., Van Boxtel, M. P. J., Verhey, F. R. J., Jansen, J. F. A., Backes, W. H. Interaction between blood-brain barrier and glymphatic system in solute clearance. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 90, 26-33 (2018).
  7. Weiss, N., Miller, F., Cazaubon, S., Couraud, P. O. The blood-brain barrier in brain homeostasis and neurological diseases. Biochimica et Biophysica Acta. 1788 (4), 842-857 (2009).
  8. Prinz, M., Priller, J. The role of peripheral immune cells in the cns in steady state and disease. Nature Neuroscience. 20 (2), 136-144 (2017).
  9. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB Journal. 19 (13), 1872-1874 (2005).
  10. Liu, W. Y., Wang, Z. B., Zhang, L. C., Wei, X., Li, L. Tight junction in blood-brain barrier: An overview of structure, regulation, and regulator substances. CNS Neuroscience & Therapeutics. 18 (8), 609-615 (2012).
  11. Siegenthaler, J. A., Sohet, F., Daneman, R. Sealing off the cns’: Cellular and molecular regulation of blood-brain barriergenesis. Current Opinion in Neurobiology. 23 (6), 1057-1064 (2013).
  12. Brightman, M. W., Reese, T. S. Junctions between intimately apposed cell membranes in the vertebrate brain. Journal of Cell Biology. 40 (3), 648-677 (1969).
  13. Reese, T. S., Karnovsky, M. J. Fine structural localization of a blood-brain barrier to exogenous peroxidase. Journal of Cell Biology. 34 (1), 207-217 (1967).
  14. Mahringer, A., Fricker, G. Abc transporters at the blood-brain barrier. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 12 (5), 499-508 (2016).
  15. Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: Developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Developmental Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
  16. Armulik, A., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
  17. Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
  18. Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews. Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  19. Heithoff, B. P., et al. Astrocytes are necessary for blood-brain barrier maintenance in the adult mouse brain. Glia. 69 (2), 436-472 (2021).
  20. Verkman, A. S. Aquaporin water channels and endothelial cell function. Journal of Anatomy. 200 (6), 617-627 (2002).
  21. Wolburg, H., Lippoldt, A. Tight junctions of the blood-brain barrier: Development, composition and regulation. Vascular Pharmacology. 38 (6), 323-337 (2002).
  22. Sagare, A. P., Bell, R. D., Zlokovic, B. V. Neurovascular dysfunction and faulty amyloid beta-peptide clearance in alzheimer disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (10), a011452 (2012).
  23. Kapasi, A., Schneider, J. A. Vascular contributions to cognitive impairment, clinical alzheimer’s disease, and dementia in older persons. Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (5), 878-886 (2016).
  24. Blanchard, J. W., et al. Reconstruction of the human blood-brain barrier in vitro reveals a pathogenic mechanism of apoe4 in pericytes. Nature Medicine. 26 (6), 952-963 (2020).
  25. Huang, Z., et al. Blood-brain barrier integrity in the pathogenesis of alzheimer’s disease. Frontiers in Neuroendocrinology. 59, 100857 (2020).
  26. Morgan, L., et al. Inflammation and dephosphorylation of the tight junction protein occludin in an experimental model of multiple sclerosis. 神経科学. 147 (3), 664-673 (2007).
  27. Kirk, J., Plumb, J., Mirakhur, M., Mcquaid, S. Tight junctional abnormality in multiple sclerosis white matter affects all calibres of vessel and is associated with blood-brain barrier leakage and active demyelination. Journal of Pathology. 201 (2), 319-327 (2003).
  28. Balasa, R., Barcutean, L., Mosora, O., Manu, D. Reviewing the significance of blood-brain barrier disruption in multiple sclerosis pathology and treatment. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 8370 (2021).
  29. Marchi, N., Granata, T., Ghosh, C., Janigro, D. Blood-brain barrier dysfunction and epilepsy: Pathophysiologic role and therapeutic approaches. Epilepsia. 53 (11), 1877-1886 (2012).
  30. Kiani, L. Blood-brain barrier disruption following seizures. Nature Reviews. Neurology. 19 (4), 2023 (2023).
  31. Knowland, D., et al. Stepwise recruitment of transcellular and paracellular pathways underlies blood-brain barrier breakdown in stroke. Neuron. 82 (3), 603-617 (2014).
  32. Okada, T., Suzuki, H., Travis, Z. D., Zhang, J. H. The stroke-induced blood-brain barrier disruption: Current progress of inspection technique, mechanism, and therapeutic target. Current Neuropharmacology. 18 (12), 1187-1212 (2020).
  33. Gireud-Goss, M., Mack, A. F., Mccullough, L. D., Urayama, A. Cerebral amyloid angiopathy and blood-brain barrier dysfunction. Neuroscientist. 27 (6), 668-684 (2021).
  34. Mesentier-Louro, L. A., Suhy, N., Broekaart, D., Bula, M., Pereira, A. C., Blanchard, J. W. Modeling the blood-brain barrier using human-induced pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 2683, 135-151 (2023).
  35. Qian, T., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Science Advances. 3 (11), e1701679 (2017).
  36. Wang, K., et al. Robust differentiation of human pluripotent stem cells into endothelial cells via temporal modulation of etv2 with modified mrna. Science Advances. 6 (30), eaba7606 (2020).
  37. Patsch, C., et al. Generation of vascular endothelial and smooth muscle cells from human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 17 (8), 994-1003 (2015).
  38. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human es and ips cells by dual inhibition of smad signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  39. Tcw, J., et al. An efficient platform for astrocyte differentiation from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 9 (2), 600-614 (2017).
  40. Zlokovic, B. V. The blood-brain barrier in health and chronic neurodegenerative disorders. Neuron. 57 (2), 178-201 (2008).
  41. Daneman, R. The blood-brain barrier in health and disease. Annals of Neurology. 72 (5), 648-672 (2012).
  42. Cecchelli, R., et al. Modelling of the blood-brain barrier in drug discovery and development. Nature Reviews. Drug Discovery. 6 (8), 650-661 (2007).
  43. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).
  44. Erickson, M. A., Wilson, M. L., Banks, W. A. In vitro modeling of blood-brain barrier and interface functions in neuroimmune communication. Fluids Barriers CNS. 17 (1), 26 (2020).
  45. Musafargani, S., et al. Blood brain barrier: A tissue engineered microfluidic chip. Journal of Neuroscience Methods. 331, 108525 (2020).
  46. Hajal, C., et al. Engineered human blood-brain barrier microfluidic model for vascular permeability analyses. Nature Protocols. 17 (1), 95-128 (2022).
  47. Oddo, A., et al. Advances in microfluidic blood-brain barrier (bbb) models. Trends in Biotechnology. 37 (12), 1295-1314 (2019).

タグ

Blood-brain BarrierIn Vitro ModelAlzheimer’s DiseaseNeurodegenerationCerebrovascular PathologyAPOE4AmyloidInduced Pluripotent Stem CellsPersonalized TherapyDrug Screening3D ModelBBB FunctionCerebral Amyloid Angiopathy

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
記事を引用
Goldman, C., Suhy, N., Schwarz, J. E., Sartori, E. R., Rooklin, R. B., Schuldt, B. R., Mesentier-Louro, L. A., Blanchard, J. W. Reconstruction of the Blood-Brain Barrier In Vitro to Model and Therapeutically Target Neurological Disease. J. Vis. Exp. (200), e65921, doi:10.3791/65921 (2023).
引用ダウンロード
転載と許可

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image