T4 Bacteriofaag en E. coli Interactie in de Muizendarm: een prototypisch model voor het bestuderen van gastheer-bacteriofaagdynamiek in vivo

Bacteriofagen, of fagen, zijn virussen die bacteriën infecteren en doden met soort- en stamspecificiteit¹. Fagen spelen een belangrijke rol binnen complexe bacteriële gemeenschappen zoals de darmmicrobiota, waar ze betrokken zijn bij het reguleren van de populatiedynamiek en het stimuleren van bacteriële fitheid^. Gedurende het afgelopen decennium is er hernieuwde belangstelling geweest voor faagonderzoek als gevolg van de opkomst van antimicrobieel resistente pathogenen³ en het potentieel voor faagtherapie als alternatieve behandelingsstrategie. In de afgelopen jaren zijn lytische faagcocktails met enig succes intraveneus gebruikt bij ernstige, antibioticaresistente bacteriële septische infecties bij mensen ^3,4. Orale faagtherapie is ook voorgesteld als een mogelijk alternatief voor antibiotica om darminfecties en ontstekingen te behandelen. Bovendien zijn fagen betrokken bij het succes van fecale filtraattransplantaties (FFT), dit zijn fecale microbiotapreparaten die zijn gefilterd om bacteriën te verwijderen, bij de behandeling van recidiverende Clostridioides difficile-infectie (rCDI)^5,6, inflammatoire darmaandoeningen (IBD)^7,8 en necrotiserende enterocolitis bij te vroeg geboren varkens⁹. Gezien deze resultaten is het belangrijk om rekening te houden met interacties tussen zowel fagen en de darmmicrobiota, als fagen en de gastheer van zoogdieren, aangezien de toevoeging van nieuwe fagen aan een reeds bestaande gemeenschap indirecte effecten kan hebben op de gemeenschap als geheel, en niet alleen op de doelbacteriën2,10.

De studie van faaginteracties met hun doelbacteriën in vitro is nuttig gebleken voor het begrijpen van de mechanismen en effecten van faag- en bacterie-interacties in de darm. In deze setting is aangetoond dat Escherichia coli-specifieke T4-fagen van de orde Caudovirales immunoglobuline (Ig)-achtige domeinen nodig hebben die zich bevinden in zeer antigene buitenste capside (Hoc)-eiwitten op het virionoppervlak om zich te hechten aan darmslijm¹¹. Bovendien hebben transwell-tests aangetoond dat T4-fagen in staat zijn om te interageren met epitheelcelculturen en door cellagen te transloceren door macropinocytose^12,13. Deze resultaten ondersteunen de hypothese dat fagen kunnen interageren met hun metazoaire gastheer, ook al zijn ze niet in staat om eukaryote cellen te infecteren. Deze modellen, hoewel nuttig, missen het volledige scala aan complexe interacties die plaatsvinden in een darmecosysteem die nodig zijn voor een uitgebreide verkenning van de tripartiete interactie tussen fagen, bacteriën en de metazoaire gastheer.

Muismodellen zijn een belangrijk hulpmiddel voor het onderzoeken van fagen binnen complexe omgevingen. Een wenselijke toepassing van faagtoediening is als een alternatieve strategie voor de behandeling van antimicrobieel resistente infecties of pathobionten geassocieerd met chronische ontstekingsziekten, waaronder IBD. Opkomende literatuur suggereert echter dat faaggedrag in vitro niet volledig representatief is voor in vivo functies. Buttimer et ^al.14 toonden aan dat een faagcocktail in staat was om de beoogde bacteriën in vitro uit te putten in een vereenvoudigd consortium voor menselijke microbiota, maar niet in vivo kon worden gerepliceerd in gnotobiotische muizen die waren gekoloniseerd met hetzelfde bacterie-faagconsortium. Bovendien leidde de T7-faag in een conventioneel microbioom van muizen tot selectieve uitputting van de beoogde darmbacteriën, hoewel geleidelijk herstel in de loop van de tijd werd waargenomen, wat wijst op geëvolueerde resistentie¹⁵. Andere studies hebben het naast elkaar bestaan aangetoond van oraal toegediende fagen en hun doelbacteriestammen in vivo ^2,16. Naast het naast elkaar bestaan van fagen en bacteriën, leidde de toediening van fagen inderdaad tot wijdverbreide veranderingen in de algehele samenstelling en functie van de microbiotagemeenschap ^2,16. Dit is relevant in ziekteomgevingen, aangezien verschillende onderzoeken associaties hebben gevonden tussen een verhoogde relatieve abundantie van Caudovirales en IBD ^7,8,17 die onafhankelijk waren van veranderingen in bacteriële abundantie⁷. Het blijft onbekend of dit een aanjager of gevolg is van de pathogenese van de ziekte.

De historische focus van faagonderzoek lag op de relatie tussen een faag en zijn doelbacterie. Het is echter ook belangrijk om rekening te houden met mogelijke interacties tussen faag en het slijmvlies, het epitheel en het immuunsysteem van de metazoaire gastheer. Deze interacties spelen allemaal een belangrijke rol in de algehele respons op een darmfaaginfectie. Om dit aan te tonen, zijn fagen bestudeerd met behulp van kiemvrije (GF) muizen om hun impact op het immuunsysteem op te helderen zonder interferentie door de microbiota⁸. In dit systeem werden faagnucleïnezuren gedetecteerd door Toll-like receptoren (TLR’s) die zich in endosomen van fagocytische immuuncellen (macrofagen en dendritische cellen) bevinden. Dit activeerde stroomafwaartse signalering en stimuleerde T-celafhankelijke productie van interferon (IFN)-γ⁸ of type I IFN’s¹⁸. Bovendien impliceerden Flückiger et ^al.19 geheugen CD8⁺ T-cellen bij de herkenning van faag-gecodeerde (profag) antigenen, wat resulteerde in kruisreactiviteit van T-cellen met tumorantigenen, wat resulteerde in verminderde tumorbelasting. Ten slotte is de productie van faagspecifieke antilichamen gedocumenteerd in muizenstudies waarbij fagen op een continue manier aan diermodellen werden toegediend via drinkwater ^8,20, of door herhaalde orale maagsonde gedurende meerdere maanden²⁰, wat het vermogen van faageiwitten aantoont om humorale immuunresponsen te bevorderen. Hoewel deze manieren van faaginoculatie een optimale en voortdurende priming van het immuunsysteem mogelijk maken, vertegenwoordigen ze mogelijk niet de natuurlijk voorkomende interacties tussen fagen en het darmmilieu, noch de kinetiek van oraal toegediende faagtherapie. Tot nu toe heeft een beperkt aantal studies de interacties van fagen met een enkele bacteriesoort onderzocht in monocolonized muismodellen²¹. Muizen met monokolonisatie bleken echter van cruciaal belang bij het ontcijferen van microbe-specifieke effecten van individuele soorten op het maagdarmkanaal (GI) en de ontwikkeling van het immuunsysteem22,23,24, en ze kunnen nog nuttig blijken te zijn bij het begrijpen van tripartiete interacties tussen fagen, hun doelbacteriën en de metazoaire gastheer.

Opwindend is dat er nog veel te leren valt over de interacties tussen darmfaag en darmcommensale bacteriën, evenals de interacties die optreden tussen de metazoaire gastheer en de fagen die erin verblijven. Dit protocol biedt een reeks procedures om geïsoleerde T4-faag en zijn bacteriële tegenhanger, E. coli (K-12, BW25113), te bestuderen met behulp van een gnotobiotisch muismodel. Deze gestandaardiseerde procedures bieden ook een basis voor het optimaliseren van andere faag/bacterie-dyades door de groeiparameters aan te passen aan de paren van belang. De hier beschreven methoden beschrijven: (1) Bereiding van T4-faag en vehiculumlysaten voor orale sonde van muizen; (2) Orale toediening van T4-faag aan gnotobiotische muizen met E. coli monokolonisatie; (3) Monitoring van T4-faagniveaus in uitwerpselen en weefsels van muizen in de loop van de tijd.

Voor de representatieve resultaten die hier worden gepresenteerd, werden gezuiverde T4-faaglysaten vermeerderd uit faagbankvoorraden die worden bijgehouden door het Rohwer Lab. De faag-op-tap-methode voor de vermeerdering van T4-fagen is aangepast²⁵, zoals vermeld in dit protocol. De methode levert binnen drie dagen endotoxine-lage faagvoorraden met een hoge titer op. Met behulp van deze aanpak werden routinematig 10 ml ≥ 10¹⁰ plaquevormende eenheden (pfu)/ml T4-faag met < 0,5 endotoxine-eenheden (EU)/ml verzameld. De aanbevolen endotoxineniveaus voor orale of intraveneuze toediening aan muizen zijn respectievelijk ≤ 20 EU/ml en ≤ 5 EU/kg/u (of 0,1 EU toegediend gedurende 1 uur voor een muis van 20 g), waardoor dit een geschikte methode is voor de bereiding van fagen voor in-vivo-inoculatie . Alle faagvoorraden werden bij 4 °C opgeslagen in een faagbuffer van zout magnesium (SM) (recept in stap 1.1.5.1). E. coli werd gekweekt in LB-media. Voor verschillende faag-bacterieparen kunnen diverse kweekmedia en groeiomstandigheden worden aangepast aan dit protocol. Fagen kunnen ook afkomstig zijn uit de omgeving, zoals afvalwater, zeewater, bodem en darminhoud en kunnen worden geïsoleerd en gezuiverd volgens Sambrook en Russell²⁶ voorafgaand aan de bereiding met behulp van de juiste groei- en voortplantingsomstandigheden voor elk faag-gastheerpaar van belang²⁵. Als alternatief kunnen fagen worden verkregen uit commerciële bronnen (zie Materiaaltabel) of uit faagbanken.