トランスレーショナルバイオメディカル研究への応用を目指したウシ一次エンテロイド由来2次元単層培養系の作製

すべてのプロトコルは、動物福祉のための制度的および国のガイドラインと規制に準拠して実施されました。 1. 試薬調製 注:この研究で使用した試薬の在庫と最終濃度を 表1に示します。 サンプル採取バッファーの調製:ペニシリン(100 U/mL)、ストレプトマイシン(100 μg/mL)、ゲンタマイシン(25 μg/mL)、カスポファンギン(2.5 μg/mL)を含む氷冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS)1 Lを混合します。原液は4°Cで保存してください。 解離試薬#1の調製:18.55 mLのサンプル採取バッファー(ステップ1.1で説明)、1.422 mLのエチレンジアミン四酢酸(EDTA、0.422 M/pH 7.4)、20 μLの1 M 1,4-ジチオスレイトール(DTT)溶液、4 μLのY-27632溶液(5000x/50 mM)を混合します。溶液を4°Cで保存します。 解離試薬#2の調製:18.57 mLの回収バッファー(ステップ1.1で説明)、1.422 mLのEDTA(0.422 M/pH 7.4)、4 μLのY-27632溶液(5000x/50 mM)を混合します。溶液を37°Cで保存します。 腸内増殖培地ストックの調製:オルガノイド増殖培地9.875 mLとサプリメント、100 μLのペニシリン(100 U/mL)、ストレプトマイシン(100 μg/mL)、5 μLのゲンタマイシン(25 μg/mL)、および20 μLのカスポファンギン(2.5 μg/mL)を混合します。溶液を4°Cで保存します。 腸内分化培地ストックの調製:オルガノイド分化培地10 mLとサプリメント、ペニシリン100 μL(100 U/mL)、ストレプトマイシン(100 μg/mL)、ゲンタマイシン5 μL(25 μg/mL)、カスポファンギン20 μL(2.5 μg/mL)を混合します。溶液は-20°Cで保存してください。 洗浄培地の準備:48.45 mLのDMEM/F-12 1.1培地(L-グルタミンを含む、HEPESを含まない)、ビタミンAを含まないB-27サプリメント1 mL(50倍ストック)、500 μLのペニシリン(100 U/mL)、ストレプトマイシン(100 μg/mL)、25 μLのゲンタマイシン(50 mg/mLストック)、および25 μLのカスポファンギン(5 mg/mLストック)を混合します。溶液を4°Cで保存します。 コーティングバッファーの調製:25 mLのDMEM:F12インヒビターなし培地と25 mgのウシ血清アルブミン(BSA)を混合します。溶液を4°Cで保存します。 2. 全組織からの腸陰窩の単離(図1) 注:ウシ小腸エンテロイドは、地元の牛肉加工工場から健康な成体のホルスタイン去勢牛(>2歳)から得られた回腸組織から生成されました。この一連の実験には1人のドナーが用いられた。 腸組織サンプルの調製採取した~10インチ(25cm)の腸組織サンプルを~400 mLの氷冷採取バッファー(PBS+抗生物質/抗真菌薬)に入れ、氷上に載せて実験室に輸送します。 外科用ハサミ(メイヨーハサミなど)と鉗子(アドソン鉗子など)を使用して、腸組織サンプルから余分な脂肪と腸間膜を取り除きます。 ティッシュを2等分に切ります。 手術用ハサミで組織を縦方向に開き、滅菌PBSで組織をすすぎます。 滅菌ガラス顕微鏡スライドの側面を使用して腸サンプルの粘液層を静かに除去し、新鮮なPBSで組織をすすぎます。注:このステップは、絨毛を除去するのに役立ち、後続のステップで陰窩画分の純度を高めるのに役立ちます。 5インチ(13 cm)の部分ごとに、組織を2つの2.5インチ(6.5 cm)に切断し、次に各部分を4つのほぼ等しい小片に切断して、組織の解離を促進します。 腸組織の解離滅菌済みの50 mLコニカルチューブに20 mLの組織解離試薬#1を調製し、容量の変位によってメニスカスがコニカルチューブの20 mLマークから35 mLマークに移動するまで、小さな組織サンプルをコニカルチューブに堆積させます。 残りの小腸組織サンプル片について、上記の手順を繰り返します。 円錐形チューブをパラフィルムで密封し、円錐形チューブを手動で10回振とうします。注意: プロトコル全体を通して、手動振とうは意図的かつ穏やかな方法で行う必要があります。 円錐形のチューブを、軌道振とうプラットフォーム上の容器の氷の上に水平に置きます。 容器内の氷の上で円錐形のチューブを毎分80回転(rpm)で30分間振とうします。10分ごとに、円錐形のチューブを手動で振ってください。 50 mLのコニカルチューブに、20 mLのプレウォーム(37°C)組織解離試薬#2(上記のように調製、ただしDTTなし)を調製します。解離試薬#1を含む円錐管から解離試薬#2を含む円錐管に組織サンプルを堆積させます。 円錐形のチューブをパラフィルムで密封し、手動で円錐形のチューブを10回振ってください。 コニカルチューブを予め温めた(37°C)振とう水浴に入れ、約60°Cの角度で傾け、150rpmで10分間振とうし、5分後に手動で振とうし、合計10分のインキュベーション後に再度振とうします。 クリプトフラグメントの分離10個の滅菌円錐形チューブ#1-#10にラベルを付けます。20 mLの滅菌氷冷PBSを各標識コニカルチューブに加えます。 解離試薬#2を含むコニカルチューブから、氷冷PBS #1を含む新しい滅菌50 mLコニカルチューブに組織片を移します。 円錐形のチューブを手動で10回振ってください。 円錐形のチューブをパラフィルムで密封し、氷の上に水平に置きます。オービタルシェーカーで円錐形のチューブを80rpmで10分間振とうします。10分後、コニカルチューブ#1を手動で10回振とうします。これはウォッシュ#1と見なされます。 一対の外科用鉗子を使用して組織サンプルを円錐形チューブ#2に静かに移します。 手順2.3.2〜2.3.4を繰り返します、これはウォッシュ#2と見なされます。 洗浄#10まで洗浄を繰り返します。 各洗浄液の上清には、エンテロイド生成に使用される陰窩が含まれています。上清の入ったチューブを、10回の洗浄がすべて完了するまで4°Cに保ちます。 10回目の 洗浄が完了し、組織切片を廃棄した後、コニカルチューブ#6-#10の上清を400 x g で4°Cで2分間遠心分離し、単離された陰窩をペレット化します。注:洗浄6〜10には、破片や単一細胞が限られている無傷の陰窩の最もきれいな画分が含まれています。そのため、これらの画分のみをエンテロイド生成に使用し、以前の洗浄(#2-#5)は破棄することをお勧めします 上清を廃棄し、再懸濁せずに4 mLの新鮮で氷冷したPBSを陰窩に加えます(これにより、顕微鏡検査まで断片を無傷に保つことができます)。 各円錐形チューブ#6-#10の解離陰窩の純度を顕微鏡で評価します。50 μL の PBS を 384 ウェルプレートに添加します。 PBSに10 μLの陰窩懸濁液を加え、倍率40倍の対物レンズを使用して陰窩の純度、完全性、および数を決定します。注意: プレートウェルの底に十字を描くと、カウントが簡単になります。 3. ウシ回腸エンテロイドの ex vivo 生成と継代(図2) 注:最も純粋で無傷の腸陰窩を持つ円錐形チューブからの陰窩は、下流のアッセイに使用されます。陰窩とエンテロイドを含むすべてのステップでは、ピペットチップ、細胞スクレーパー、およびチューブをコーティングバッファーで事前にコーティングし、陰窩の損失を防ぐために気泡を避ける必要があります。特に断りのない限り、1000 μLのピペットチップを使用して、クリプトフラグメントの破砕を防ぐ必要があります。 陰窩の断片からエンテロイドを生成する最も純粋な陰窩画分(通常は#6-#10)を1つの円錐形のチューブに結合します。 陰窩を含むコニカルチューブを400 x g で4°Cで2分間遠心分離します。 上清をピペットで吸引して廃棄し、クリプトペレットをウォッシュメディアに再懸濁します。 ステップ3.1.2のように遠心分離します。上清をデカントし、2 mLのウォッシュメディアをクリプトペレットに加えます。 手順2.3.11.1の説明に従って、クリプトの数を数えます。 ステップ3.1.2と同様に遠心分離して陰窩をペレット化し、上清を廃棄し、氷冷した100%還元成長因子基底膜細胞外マトリックス(BME)に再懸濁して、約400クリプト/100μLの濃度にします。注:BMEは、温度変化によって粘稠度が変化するため、4°Cで適切に融解することが重要です。BMEは、冷却ブロックと事前に冷却されたピペットチップを使用して、早期に固化するのを防ぐことができます。別の基底膜マトリックス組成物を使用すると、ドームを作成する際にBMEの希釈が必要になる場合があります。使用しているBMEに固有の製造元の指示を参照してください。 ピペットを上下に動かして、BMEの陰窩を完全に吊り下げます。 crypt-BME懸濁液50 μLを、37°Cに設定した加温プレート上の6ウェル組織培養プレートに、最大8個のドーム/ウェルでゆっくりとピペッティングすることにより、crypt-BMEドームを作製します。注:6ウェルプレートは、ドームのメッキの前に、インキュベーターで37°Cで一晩予熱する必要があります。 6ウェルプレートを加温プレート上に1分間置いてから、プレートを37°C、5%CO2 インキュベーターに慎重に移動させます。 2分後、蓋が下を向くように6ウェルプレートを裏返し、さらに30分間インキュベートしてドームを重合させます。 30分後、10 μMのSB202190、0.5 μMのLY2157299、および10 μMのY-27632を添加した3 mLの室温(RT)エンテロイド増殖培地を、ドームを含むウェルに慎重に加えます。 37°C、5%CO2でインキュベートします。 培地を取り除き、2〜3日ごとに阻害剤を添加した新しい腸内増殖培地と交換します。 エンテロイドの継代7〜10日後、陰窩が 図2Eのように多くの出芽構造を持つ3Dエンテロイドを形成し、継代する準備ができていることを確認します。 ドームを含むウェルから培地を捨てます。 ウェルあたり4つのドームごとに、10 μM Y-27632を添加した氷冷非酵素細胞解離溶液1 mLをドームを含む各ウェルに加えます。 プレコートされた細胞スクレーパーを使用して、ドームを組織培養プレートから静かに取り外します。 エンテロイドを15 mLのコニカルチューブに集め、ピペッティングで10回上下させて粉砕します。 断片化したエンテロイドを含むコニカルチューブを、80rpmのオービタルシェーカーで10分間室温でインキュベートします。 10 mLの氷冷洗浄培地を10 μM Y -27632のエンテロイドに加えます。 コニカルチューブを 300 x g で 5 分間遠心分離します。 上清を廃棄し、ペレットを10 mLの新鮮な洗浄液に再懸濁し、新しい15 mLコニカルチューブに移します。 コニカルチューブを 300 x g で 5 分間遠心分離します。 上清を廃棄し、ペレットを1.5 mL微量遠心チューブ中の1 mLの腸内増殖培地に再懸濁します。 微量遠心チューブを300 x g で5分間室温で遠心分離し、上清を廃棄します。 エンテロイドペレットを氷冷100%BMEに再懸濁し、手順3.1.6-3.1.13に従います。 7日ごとの再通過エンテロイド。増殖時間は、出芽の密度、生存率、および程度によって異なる場合があります。大きなエンテロイド構造を形成する複数の出芽構造は、エントロイドを継代する必要があることを示しています。 エンテロイドの凍結保存凍結保存のために、エンテロイドが培養中に5回以上継代されていないことを確認してください。注:これは実験的にテストされておらず、後のパッセージが生存率を低下させ、さまざまな結果をもたらすという著者の観察に基づいています。 エンテロイドを回収するには、ステップ3.2.2-3.2.9で説明したように解離バッファーを使用します。注:5 mLピペットを使用してエンテロイドを機械的に解離します。 ステップ2.3.11.1の説明に従って、エンテロイドフラグメントの数をカウントします。 コニカルチューブを 300 x g で 5 分間遠心分離します。 上清を廃棄し、10 μM Y-27632 を添加した凍結保存培地にエンテロイド断片を再懸濁して、濃度を ~2000 エンテロイド断片/mL とし、1 mL をあらかじめ標識したクライオバイアルに分注します。 クライオバイアルを管理された凍結容器に入れ、-80°Cで一晩保存します。 クライオバイアルを気相液体窒素に移し、長期保存します。 腸陰窩断片の蘇生インキュベーター内に6ウェルプレートを一晩置きます。 5 mLのチューブに5 mLのコーティング剤をプレコートします。 液体窒素貯蔵庫からクライオバイアルを取り出します。 解凍したらすぐに、クリオバイアルからプレコートされた5 mLチューブに陰窩を移します。クライオバイアルをウォッシュメディアで洗い流し、5 mLチューブに加えます。気泡を避けてください。 ウォッシュメディアで容量を5 mLまで上げ、400 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 遠心分離中に、1.5 mLチューブにコーティング剤をプレコートします。 遠心分離後、上清を流し出し、チューブ内に残っている培地にペレットを再懸濁し、プレコートした1.5mLチューブに移します。5 mL チューブを洗浄培地で洗浄し、1.5 mL チューブに移します。400 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 Enteroid Growth Mediaで容量を1.5 mLまで増やします。 上記のように遠心分離し(ステップ3.4.7)、慎重に吸引します。 BMEを4°Cから採取し、氷/氷の塊の上に置きます。 エンテロイドペレットを氷冷100%BMEに再懸濁し、手順3.1.6〜3.1.12に従います。 2〜3日ごとにメディアを交換してください。 4. 3次元エンテロイドからの2次元単分子膜の作製と評価 注:上記のように、陰窩とエンテロイドを含むすべてのステップでは、ピペットチップ、セルスクレーパー、およびチューブをコーティングバッファーで事前にコーティングし、陰窩の損失を防ぐために気泡を避ける必要があります。 2D単分子膜形成のためのトランズウェルインサートの作製インサートを 24 ウェル組織培養アダプタープレートにセットし、1 μm PET 24 ウェル細胞培養インサートの頂端側を、100 μL の 1:15 希釈混合 BME をエンテロイド増殖培地にプレコートします。バリアの完全性測定を行う際のコントロールとして使用される追加のインサートを必ずコーティングしてください。 コーティングされたインサートをインキュベーター内の24ウェル組織培養アダプタープレートに入れます。注:トランズウェルインサートには、特定のアダプターまたはコンパニオン組織培養プレートを使用する必要があります。 培養インサートを37°C、5%CO2 で1時間インキュベートし、重合させます。注:BMEコーティングされたトランズウェルは、パラフィルムで密封し、すぐに使用しない場合は最大1週間4°Cで保存できます。 インキュベーションの最後に、3Dエンテロイド培地を吸引します。 3Dエンテロイドの解離上記のセクション3.1で説明したように蘇生、播種、培養した凍結保存された腸内膜断片から2Dエンテロイド単層を生成し、3Dエンテロイドを形成します。融解したエンテロイドを少なくとも2回継代し、最後の継代を最低5日間培養してから処理し、2D単層培養物を生成します。 10 μM Y-27632 を添加した氷冷ウォッシュ培地をエンテロイドドームに添加してエンテロイドを回収します(4 ドームに約 1 mL の解離バッファーを使用) セルスクレーパーでドームを取り外し、15 mLのコニカルチューブに集めます。 1 mLのピペットチップを使用して30回トリチュレートし、エンテロイドフラグメントを生成します。 200 μLのピペットチップで40回トリチュレートし、エンテロイド断片をさらに分解します。 エンテロイド断片を含む 15 mL コニカルチューブの容量を氷冷洗浄培地で 10 mL にします。 コニカルチューブを 300 x g で 5 分間遠心分離します。 BME層を含む上清を、エンテロイドペレットを乱さないように注意しながら吸引する。注:BME層は、ペレットのすぐ上に曇ったゼラチン状の層として表示されます。 4ドームごとに、10 μMのY-27632を添加した1 mLの予熱済みTrypLE発現酵素にペレットを再懸濁します。 エンテロイドとTrypLEの混合物を24ウェルプレートに添加し、37°C、5% CO2 で10分間インキュベートします。 10分後、1 mLピペットを使用してエンテロイド-TrypLE混合物を40回ピペットし、エンテロイドをさらに断片化します。 次に、200 μLのピペットで断片を40回ピペットで移し、断片を単一細胞に分解します。 滅菌済み 22-G ニードルを取り付けた 3 mL または 5 mL シリンジを使用して、細胞懸濁液を 4 回吸引および分注し、単一細胞懸濁液を実現します。 ステップ2.3.11.1で説明したように、エンテロイドの80%が単一細胞に分解されるまで、顕微鏡で細胞の解離を監視します。 細胞懸濁液を 15 mL のコニカルチューブに集め、10% FBS を添加した 4 倍の量の Wash Media を添加して酵素反応をクエンチします。 エンテロイドをプレコートされた40 μmセルストレーナーで50 mLのコニカルチューブに2回ろ過します。 コニカルチューブを300 x g で5分間遠心分離することにより、単一細胞をペレット化します。 トランズウェルインサートの2D単層シーディング。上清をデカントし、20%ウシ胎児血清(FBS)を添加した少量(~600 μL)のオルガノイド増殖培地にペレットを室温で再懸濁します。 腸内細胞の密度と生存率を、トリパンブルー色素排除法、血球計算盤、または自動セルカウンターを用いて測定します。平均生存率は75%と予想されます。 細胞を播種する直前に、ステップ1.3で塗布した余分なコーティング溶液を細胞培養インサートから慎重に取り除きます。 プレコートされた細胞培養インサートの頂端表面に、インサートあたり200 μLの容量で1 x 105 細胞を播種します。 20% FBSを添加した700 μLの完全培地を細胞培養インサートの基底側に加えます。 プレートを番号8の形に10回操作して、細胞がインサート全体に均等に広がるようにします。 プレートをプレートウォーマーの上にバイオセーフティキャビネットで10分間保管します。 プレートを37°C、5%CO2でインキュベートします。 48時間後、頂端および基底コンパートメントの培地を、20Sおよび阻害剤を添加した新鮮な腸内増殖培地と交換します。 3日目に、頂端および基底外側コンパートメントから培地を取り除き、インサートを1x PBSで慎重に洗浄し、阻害剤のみを添加した腸内分化培地と交換します。 両方のコンパートメントのメディアを2〜3日ごとに交換します。 上皮バリアの完全性と単層コンフルエントの定量的測定注:バリアの完全性は、上皮ボルトオーム計を使用して経上皮電気抵抗(TEER)を測定することで評価できます。トランズウェル培養プレートをインキュベーターから取り出し、バイオセーフティキャビネット内で室温で数分間平衡化させます。 STX2電極が事前に調整され、電圧抵抗計が製造元の指示に従って1000Ωに校正されていることを確認してください。 プローブの長いスティックを基底外側コンパートメントに挿入し、短い方の端をトランズウェル上皮細胞培養の頂端コンパートメントに挿入します。単層を破壊したり、インサートを損傷したりしないように注意してください。 安定したら、トランズウェルインサートごとに3つのTEER測定値を記録します(セルなしのインサートを含む)。各チップの測定値の平均を取ります。 実験ウェルの平均測定値からブランクウェルの平均測定値を差し引き、それにインサートの表面積を掛けて上皮バリアの抵抗を決定することにより、補正されたTEER値を計算します(TEER [Ω.cm2] = [Rcell層-Rblank]×面積)。