Activación neuronal remota junto con muestreo de sangre automatizado para inducir y medir la hormona luteinizante circulante en ratones

Todos los procedimientos con animales se realizan de acuerdo con la Guía del Consejo Nacional de Investigación para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio18 , así como con las leyes federales, estatales y locales. Para esta demostración del protocolo se utilizaron ratones hembra adultos (de 3 a 6 meses de edad), incluidas cuatro hembras C57BL/6J y cuatro Kiss1-Cre; ChR2-eYFP (Kiss1-eYFP) hembras. Los ratones se mantuvieron bajo un ciclo de luz-oscuridad de 12:12, con temperatura controlada a 22 °C, y se alimentaron ad libitum con una dieta baja en fitoestrógenos. Los procedimientos y protocolos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Michigan (IACUC, Protocolos Animales: PRO00010420 y PRO00010138). 1. Entrega estereotáxica de AAVs a una población celular específica Preparación para la cirugíaEsterilice todas las herramientas. Prepare varios paquetes de herramientas quirúrgicas para asegurarse de que cada paquete se use en no más de cinco animales. Preparar guantes estériles, un mínimo de un par para cada animal. Tire de las micropipetas de vidrio para inyecciones utilizando los siguientes ajustes (consulte la Tabla de materiales) para micropipetas largas y delgadas que inyectan lenta y constantemente y no se obstruyen fácilmente: Calor 1: 915, Calor 2: 630, Tiro: 630. Optimice estos ajustes para cada extractor. Realizar cirugías en un espacio quirúrgico designado. Desinfectar las superficies quirúrgicas con etanol al 70%. Utilice paños estériles para mantener la esterilidad del campo quirúrgico. Use una bata de laboratorio limpia o una bata desechable y una mascarilla. Prepare el sistema de anestesia inhalatoria. Abra el suministro de oxígeno y regule el caudal a 0,8 L/min. CirugíaColoque el ratón en una caja de anestesia y abra el isoflurano al 2,5%. Reducir el flujo de isoflurano al 2% después de la inducción inicial; Mantenga el flujo durante todo el procedimiento. Para conocer los métodos alternativos de anestesia, consulte el protocolo con animales y las pautas del comité de ética local. Inyecte analgésico preventivo (carprofeno 5 mg/kg s.c.) siguiendo las recomendaciones del comité de uso de animales y las regulaciones locales. Afeita la cabeza del ratón con una maquinilla. Instale al animal en una mesa estereotáxica, coloque barras en las orejas y asegúrese de que la cabeza esté correctamente fijada y estable. Fija la boca del ratón a la boquilla, asegurándote de colocar la lengua a un lado fuera de la boca para evitar la asfixia. Verifique que el animal esté profundamente anestesiado con un pellizco en el dedo del pie antes de comenzar la cirugía y controle el aliento y el color del ratón durante todo el procedimiento. Coloque el soporte de elevación debajo del mouse para mantener el cuerpo y la cabeza nivelados en posición horizontal. Mantenga al animal caliente con una almohadilla tibia cubierta de papel. Aplique ungüento para los ojos en ambos ojos para evitar que se sequen. Mantenga el área quirúrgica lo más limpia posible. Use guantes estériles. Desinfecta la cabeza del ratón con yodo y alcohol antes de abrir la piel. Con un bisturí, corte la piel de la cabeza a lo largo de la línea media, aproximadamente desde detrás de los ojos hasta detrás de la sutura lambda. Mantenga el cráneo expuesto y límpielo con un bastoncillo de algodón incrustado en NaCl estéril al 0,9%. Busca la vena rinal rostral (RRV) y márcala con un lápiz estéril. Utilice el estereoscopio durante el resto del procedimiento.NOTA: Obtenemos mejores resultados utilizando el VRR como referencia anteroposterior, pero lo estándar es utilizar bregma como referencia. Usando una aguja estéril como referencia, asegúrese de que la orientación del cerebro sea correcta antes de proceder a las mediciones estereotáxicas. Asegúrese también de que las alturas de la superficie del cráneo en el VRR y la lambda, así como la inclinación lateral, sean las mismas (± 0,02 mm).NOTA: La inclinación lateral se vuelve más relevante para la inyección en estructuras cerebrales más laterales. Cargue una pipeta de vidrio estéril con la solución viral que se va a inyectar. Llévelo a la referencia RRV para la referencia 0 anteroposterior (AP). Avanza a lo largo de la sutura sagital hasta la coordenada AP de tu elección. Marque esta posición con un lápiz estéril, levante la aguja y proceda a la craneotomía. Taladre con cuidado un pequeño círculo alrededor de la posición marcada para evitar romper el seno sagital superior. Coloque el taladro en una posición inclinada en lugar de perpendicular para reducir la presión durante la perforación. Retire el pedazo del cráneo con unas pinzas pequeñas. Una vez expuesta la vasculatura, utilizar la parte media del seno sagital superior para utilizarla como referencia mediolateral (ML) (punto 0); Esto es más preciso que usar la sutura sagital. Muévase a la posición de ML de su elección. Baje la pipeta para tocar la duramadre como referencia dorsoventral (DV) (punto 0). Rompa ligeramente la duramadre y descienda la pipeta a la posición DV elegida. Inyecte la cantidad deseada de AAV (50-200 nL) y deje la cánula en su lugar durante 3 minutos para permitir una dispersión adecuada del líquido. Retire la pipeta con cuidado del cerebro. Suelte el mouse de las barras de los oídos. Cierre la piel con pinzas quirúrgicas o cualquier método de su elección. Coloque al animal en una jaula separada y calentada para que se recupere. Supervise la recuperación, la reactividad y la actividad después de que el mouse esté activo. Cuando esté completamente recuperado, mueva el ratón de regreso a su jaula original. Espere un mínimo de 3-4 semanas para la expresión viral antes de continuar con la segunda parte del procedimiento. 2. Canulación de la vena yugular y de la arteria carótida Preparación para la cirugíaRealizar cirugías en un espacio quirúrgico designado. Desinfectar las superficies quirúrgicas con etanol al 70% antes de iniciar los procedimientos. Prepare varios paquetes de herramientas quirúrgicas para asegurarse de que cada paquete se use en no más de cinco animales. Autoclave de todos los instrumentos quirúrgicos. Luego, limpie con agua estéril o solución salina y desinfecte las herramientas con un esterilizador de perlas caliente durante al menos 15 s (según las instrucciones del fabricante) entre cirugías. Utilice paños estériles para mantener la esterilidad del campo quirúrgico. Use una bata de laboratorio limpia o una bata desechable y una mascarilla. Preparar microcatéteres para canulaciones en la arteria carótida y la vena yugular. Construya el catéter arterial uniendo un pequeño segmento de tubo de microrrenathane (estirado desde 0.025 pulgadas de diámetro exterior [OD] x 0.012 pulgadas de diámetro interior [ID]) con un tubo de silástica (0.025 pulgadas de diámetro exterior x 0.012 pulgadas de diámetro interior). Construya el catéter venoso solo con un tubo de silicona (0.025 pulgadas de diámetro exterior x 0.012 pulgadas de diámetro interior). Remoje todos los catéteres en etanol al 70% durante la noche antes de la cirugía. Biselar las puntas de corte de ambos catéteres a 45° para preestimar longitudes basadas en el peso corporal y la longitud del animal. Procedimientos quirúrgicosAnestesiar a los animales con menos de isoflurano al 2% con un sistema de isoflurano de bajo flujo de mesa para controlar con precisión la etapa y el plano de la anestesia durante la cirugía. Inyectar la dosis preventiva de analgésico (carprofeno 5 mg/kg s.c.) y aplicar pomada oftálmica para prevenir la desecación y lesiones corneales. Afeitar las zonas ventrales y posteriores del cuello y limpiar la piel con tres exfoliantes de yodo alternados con etanol al 70%. Realice una incisión vertical en la piel (12 mm) entre los omóplatos y cúbrala con una gasa quirúrgica para su uso posterior. Coloque al animal en decúbito supino con la cabeza hacia el cirujano. Utilice un endoscopio de disección estereoscópica para la mayoría de los procedimientos que se describen a continuación. Realice una pequeña incisión vertical (~10 mm) en el lado derecho del cuello, superior a la clavícula para exponer la arteria carótida derecha y la vena yugular. Cortar la piel con unas tijeras y realizar una disección roma para separar los tejidos subcutáneos utilizando micropinzas no dentadas con puntas finas, exponiendo la vena yugular externa derecha y la arteria carótida común derecha. Ata el extremo distal de la vena yugular para detener el flujo sanguíneo y corta un pequeño orificio en la vena colapsada con micropinzas y tijeras. Inserte el catéter venoso biselado hacia abajo y proximalmente usando un par de micro pinzas para hacerlo avanzar a través de la vena cava superior hasta alcanzar el nivel de la aurícula derecha. La longitud insertada es de ~10-12 mm para un ratón magro de 30 g. Ate el catéter para fijarlo con el vaso con suturas de seda 7-0.NOTA: Con el catéter en el lugar correcto, la sangre se puede extraer fácilmente; De lo contrario, el catéter puede estar mal colocado en la vena torácica lateral y debe volver a insertarse. Diseccionar cuidadosamente los tejidos conectivos para exponer la arteria carótida común derecha ubicada en un área triangular rodeada por el músculo esternohioideo, el músculo esternomastoideo y el músculo digástrico. Use un retractor de alambre para separar estos músculos si es necesario. Atar la arteria a nivel de la bifurcación de las arterias carótidas internas y externas mediante suturas de seda 7-0. Coloque proximalmente dos asas de sutura desatadas. Detenga temporalmente el flujo sanguíneo tirando de un asa de sutura precolocada y corte o perfore un pequeño orificio en la pared del vaso con microtijeras o una aguja de 27 G. Inserte el catéter arterial biselado hacia abajo y proximalmente hasta una longitud preestimada que llegue al arco de la aorta pero sin tocar la válvula aórtica. La longitud insertada es de ~9-10 mm para un ratón magro de 30 g. Amarre el catéter para fijarlo con el vaso usando las dos suturas precolocadas. Tunelice todos los catéteres por vía subcutánea y exteriorícelos en la parte posterior del cuello a través de la incisión precortada y únalos a los puertos venosos o arteriales de un conector de tubo recubierto de silicona hecho de tubo de aguja de 25 G: MASA19 modificado con dos tubos de aguja de 25 G y dos tubos de PE-20 de 4,0 cm, enfundados con 2,0 cm de tubo de silastic de 0,062 pulgadas de diámetro interior unidos con un pequeño anillo metálico hecho de alambre. El volumen lumínico total de cada catéter, incluido el conector, es de 6-8 μL (Figura 1A). Cierre la incisión ventral y fije el conector subcutáneamente sobre el cierre de la piel posterior con suturas. Llene ambos catéteres con solución salina heparinizada (200 U/mL) y conéctelos firmemente en el extremo con alambres quirúrgicos de acero inoxidable. Los ratones se recuperan de la anestesia con isoflurano en cuestión de minutos y se recuperan completamente de la cirugía en 5 días. Coloque a los animales en la cámara automatizada de extracción de sangre 24 h después de la cirugía y conéctelos al sistema uniendo el gancho de sujeción del sistema al anillo metálico unido al conector del tubo implantado en la parte posterior del cuello. Conectar los catéteres arteriales y venosos a las líneas de inyección y muestreo, respectivamente, 24 h antes de que comience la toma de muestras (Figura 1B). La longitud total de la línea de muestreo es de 55 cm de longitud o 40 μL por volumen de lúmenes.NOTA: Se han descrito en detalle las configuraciones de las líneas de inyección y muestreo, la programación del método de recolección y los mecanismos de equilibrio de la jaula del sistema automatizado de muestreo de sangre20,21. El sistema mantiene el catéter abierto mediante la administración automática de 10 μL de solución salina heparinizada cada 20 minutos. Ajuste el tiempo y la frecuencia de muestreo previo a la inyección, inyección y posinyección a través del programa informático del sistema. Consulte el paso 3.1 a continuación para conocer la configuración actual. El sistema permite que el animal se mueva libremente sin enredar las líneas de muestreo y/o infusión al detectar el movimiento del ratón mientras gira la cámara de alojamiento en una dirección opuesta al movimiento del ratón21 (Figura 1). Vuelva a llenar la línea de infusión o inyección con el compuesto y vuelva a conectarlo al catéter venoso al menos 2 horas antes de que comience la infusión o inyección.NOTA: Pueden ocurrir complicaciones de la cirugía, y los animales deben ser monitoreados de cerca para su recuperación y en los días posteriores a la cirugía. Consulte el protocolo con animales para conocer el monitoreo, los requisitos de terminación y los procedimientos correctos. 3. Extracción de sangre automatizada e inyección intravenosa Extracción de sangre automatizadaPara seguir este protocolo, utilice un volumen de muestreo de 20,0 μL y establezca un intervalo (es decir, 7,0 min) entre cada muestreo para tener una frecuencia de muestreo de cada 10,0 min por muestra. La velocidad máxima es muestrear continuamente a 3,0 min/muestra; el volumen mínimo de muestreo posible es de 5,0 μL. El sistema devuelve automáticamente una cantidad igual de solución salina para reemplazar la sangre muestreada y mantener el equilibrio de líquidos corporales. Establezca el tiempo total de muestreo en 30 (t = -30 – 0) min antes y 30 (t = 0 – 30) min después de la inyección intravenosa de CNO (0,5 mg/kg, Figura 2). Cada muestra de sangre recolectada (20,0 μL) se diluye automáticamente en 50 μL de solución salina (que contiene heparina a 10 U/mL) y se almacena individualmente en un microtubo sostenido en un carrusel de muestras refrigerado por el sistema. Inyección intravenosa automatizadaDesconecte la vía venosa del catéter venoso para rellenar el CNO (dosis calculada individualmente por volumen de ~50-60 μL a 0,5 mg/kg) al menos 2 h antes de que comience la toma de muestras de sangre. Retirar manualmente la solución (un poco más que el volumen calculado) de la vía de forma retrógrada con la jeringa de inyección, dejando una pequeña burbuja de aire entre la solución y la solución salina existente en la vía. Vuelva a conectar la línea de inyección al catéter venoso y ajuste la velocidad de inyección a 500 μL/min y el tiempo de inicio de la inyección a 2 min después de que finalice la toma de muestras t = 0. El tiempo total de inyección para cada animal es de 5-6 s.NOTA: Si es necesario, el compuesto también se puede administrar mediante una inyección intraperitoneal manual (IP), pero esto requerirá molestar al animal durante o antes del protocolo de extracción de sangre. También mostramos esta alternativa en los resultados. 4. Perfusión animal y recolección de cerebro (OPCIONAL) NOTA: Este procedimiento debe seguirse solo si se requiere que el cerebro analice el sitio cerebral de activación neuronal o las respuestas posteriores. Desconecte el ratón del sistema de extracción de sangre al final del protocolo de recolección. Dos horas después de la inyección intravenosa, se procederá a perfundir al animal con formol tamponado neutro (NBF) al 10%, utilizando el método preferido o como se describe en otra parte22. Diseccionar el cerebro y conservarlo en sacarosa al 20% en NBF al 10% durante 3 h para continuar con la fijación. Después de 3 h, transfiera el cerebro fijo a sacarosa al 20% en PBS y conserve a 4 °C hasta que esté listo para el corte.NOTA: Evite la sobrefijación, ya que esto enmascarará los antígenos cFOS. En la solución de sacarosa al 20%, el cerebro debe hundirse hasta el fondo del recipiente. Haga secciones usando un micrótomo de congelación o criostato y use el método preferido para observar la activación neuronal (p. ej., se muestra la inmunohistoquímica cFOS).NOTA: Los anticuerpos utilizados para los resultados actuales se describen en la Tabla de Materiales. 5. Procesamiento y análisis de muestras Retire las muestras de sangre del muestreador automático inmediatamente después del final del experimento y colóquelas en hielo. Centrifugar las muestras a 14.000 × g durante 30 s. Recoge el plasma. Guárdelo a -80 °C hasta el análisis. Analizar las muestras de sangre mediante ELISA LH como se describió anteriormente 10,23.