脑卒中短暂性中动脉闭塞模型
概要
该方案描述了通过大脑中动脉腔内闭塞在小鼠中短暂性局灶性脑缺血的模型。此外，还显示了使用磁共振成像和行为测试的结果评估示例。
Abstract
中风是全球死亡或慢性残疾的主要原因。然而，现有的最佳治疗方法仅限于缺血性卒中急性期的再灌注治疗。为了深入了解中风生理学并开发创新的治疗方法，中风 的体内 啮齿动物模型起着重要作用。转基因动物的可用性特别推动了小鼠作为实验性中风模型的使用。
在卒中患者中，大脑中动脉 （MCA） 闭塞很常见。因此，最普遍的实验模型涉及 MCA 的腔内闭塞，这是一种不需要开颅手术的微创技术。该过程包括通过颈外动脉 （ECA） 插入单丝并将其推进通过颈内动脉 （ICA），直到它到达 MCA 的分支点。动脉闭塞 45 分钟后，移除单丝以允许再灌注。在整个过程中，监测脑血流以确认闭塞期间的减少和随后的再灌注恢复。使用行为测试和磁共振成像 （MRI） 研究评估神经和组织结果。
Introduction
根据世界卫生组织的数据，中风是一种毁灭性的疾病，每年影响全球约 1500 万人。大约三分之一的患者死于这种疾病，而另外三分之一的患者则经历永久性残疾。卒中是一种复杂的病理学，涉及各种细胞类型，例如神经和外周免疫细胞、脉管系统和全身反应1。目前无法使用 体外 模型复制由系统水平的中风引发的复杂反应网络。因此，实验动物模型对于深入研究疾病的机制以及开发和测试新疗法至关重要。目前，早期组织再灌注是唯一获批的干预措施，通过组织型纤溶酶原激活剂 （tPA） 溶栓或血管内血栓切除术1。
脑中动脉 （MCA） 闭塞在卒中患者中很常见。因此，最初在大鼠中开发了瞬时 MCA 闭塞 （tMCAo） 的啮齿动物模型 2,3,4。如今，转基因小鼠是实验性中风模型中最常用的动物。在这项研究中，我们描述了小鼠腔内 tMCAo 的微创模型。该方法通过颈部水平的颈动脉进行，无需开颅手术。
闭塞期的持续时间是决定缺血性病变程度的关键因素。即使是 10 分钟的短暂闭塞也会导致选择性神经元死亡，而不会出现明显的梗死，而较长时间的闭塞（通常持续 30 至 60 分钟）会导致一定程度的脑梗死。与供应皮层并具有侧支的 MCA 的近端和远端分支不同，向纹状体提供血液的透镜状体动脉缺乏侧支5。因此，在 tMCAo 之后，纹状体中的血流量比皮层中的血流量减少更大。因此，30 分钟或更短时间的闭塞通常影响纹状体但不影响皮质，而从 45 分钟开始的较长时间闭塞通常会在整个 MCA 区域（包括纹状体和背外侧皮层）产生缺血性病变。
为了确保小鼠的健康，我们在手术前使用镇痛药，并在手术过程中使用麻醉剂。然而，麻醉可能会在小鼠的生理机能中引入人为的改变，并影响一些结果测量6。当由有经验的人员进行手术干预时，通常持续约 15 分钟以诱导 MCAo。随后，麻醉下的总时间取决于闭塞期。对于最小化麻醉至关重要的实验，手术中的替代步骤是在闭塞期间停止麻醉，并将其限制在插入和拔出闭塞 MCA 的细丝的手术步骤中。这种方法缩短了麻醉的持续时间，并最大限度地减少了其对实验模型的潜在人工影响7,8。因此，诱导短暂性局灶性缺血的方法通过MCA的腔内闭塞呈现，具有两种变体：在整个闭塞期间小鼠麻醉或在此期间小鼠清醒。在任何一种情况下，假手术都应与对缺血小鼠进行的干预同时进行。此外，在再灌注后的不同时间点通过行为测试和 MRI 测量，提供有关结果评估的数据。最后，讨论了实施实验程序时要考虑的主要因素。
Protocol
Representative Results
Discussion
腔内 tMCAo 手术是基础研究中最常用的局灶性脑缺血再灌注模型。目前，由于转基因菌株的可用性，小鼠是首选的动物模型。然而，必须承认转基因小鼠及其遗传背景会影响脑血管形成。不同动脉区域之间侧支循环和吻合的存在可以显着影响实验程序的结果 11。
在执行此程序时，必须考虑某些关键点。损伤可能发生在 MCA 区域之外，累及海马体、丘脑或下丘?…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
该研究由 科学与创新部 （MCIN）/Agencia Estatal de Investigación （AEI）、 Gobierno de España/10.13039/501100011033 和“欧洲区域发展基金 （ERDF）”资助的赠款 PID2020-113202RB-I00 支持。一种创造欧洲的方式“。NCC 和 MAR 拥有由 MCIN/AEI/10.13039/501100011033 和“欧洲社会基金 （ESF） 投资您的未来”资助的博士前奖学金（分别为 PRE2021-099481 和 PRE2018-085737）。我们感谢弗朗西斯卡·鲁伊斯-哈恩和莱昂纳多·马尔克斯-基西努斯基的技术支持。我们感谢 Institut d’Investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer （IDIBAPS） 的 MRI 成像设施的支持。加泰罗尼亚政府加泰罗尼亚研究中心（CERCA）计划支持IDIBAPS。
Materials
| 6/0 suture | Arago | Vascular ligatures | |
| 6/0 suture with curved needle | Arago | Skin sutures | |
| 9 mg/mL Saline | Fresenius Kabi | CN616003 EC | For hydration |
| Anaesthesia system | SurgiVet | ||
| Blunt retractors, 1 mm wide | Fine Science Tools | 18200-09 | |
| Buprenorfine | Buprex | For pain relief | |
| Clamp applying forceps | Fine Science Tools | S&T CAF4 | |
| Dumont mini forceps | Fine Science Tools | M3S 11200-10 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| Glue | Loctite | To stick LDF probe to the skull | |
| Grip Strength Meter | IITC Life Science Inc. | #2200 | |
| Isoflurane | B-Braun | CN571105.8 | |
| LDF Perimed | Perimed | Periflux System 5000 | |
| LDF Probe Holders | Perimed | PH 07-4 | |
| Medical tape | |||
| MRI magnet | Bruker BioSpin, Ettlingen, Germany | BioSpec 70/30 horizontal animal scanner | |
| Needle Holder with Suture Cutter | Fine Science Tools | 12002-14 | |
| Nylon filament | Doccol | 701912PK5Re | |
| Recovery cage with heating pad | |||
| Sirgical scissors | Fine Science Tools | 91401-12 | |
| Small vessel cauterizer kit | Fine Science Tools | 18000-00 | |
| Stereomicroscope and cold light | Leica | M60 | |
| Suture tying forceps | Fine Science Tools | 18025-10 | |
| Thermostat, rectal probe and mouse pad | Letica Science Instruments | LE 13206 | |
| Vannas spring scissors (4mm cutting edge) | Fine Science Tools | 15019-10 | |
| Vascular clamps | Fine Science Tools | 00396-01 |
参考文献
- Siddiqi, A. Z., Wadhwa, A. Treatment of acute stroke: current practices and future horizons. Cardiovascular Revascularization Medicine. 49, 56-65 (2023).
- Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 1, 53-60 (1981).
- Koizumi, J., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema. A new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Japanese Journal of Stroke. 8, 1-8 (1986).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, R., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Hossmann, K. A. Cerebral ischemia: Models, methods, and outcomes. Neuropharmacology. 55, 257-270 (2008).
- Seto, A., et al. Induction of ischemic stroke in awake freely moving mice reveals that isoflurane anesthesia can mask the benefits of a neuroprotection therapy. Frontiers in Neuroenergetics. 6, 1 (2014).
- Díaz-Marugan, L., et al. Poststroke lung infection by opportunistic commensal bacteria is not mediated by their expansion in the gut microbiota. Stroke. 54 (7), 1875-1887 (2023).
- Xie, L., Kang, H., Nedergaard, M. A novel model of transient occlusion of the middle cerebral artery in awake mice. Journal of Natural Sciences. 2 (2), e176 (2016).
- Arbaizar-Rovirosa, M., et al. Aged lipid-laden microglia display impaired responses to stroke. EMBO Molecular Medicine. 15 (2), e17175 (2023).
- Orsini, F., et al. Targeting mannose-binding lectin confers long-lasting protection with a surprisingly wide therapeutic window in cerebral ischemia. Circulation. 126 (12), 1484-1494 (2012).
- Majid, A., et al. Differences in vulnerability to permanent focal cerebral ischemia among 3 common mouse strains. Stroke. 31, 2707-2714 (2000).
- Rogers, D. C., Campbell, C. A., Stretton, J. L., Mackay, K. B. Correlation between motor impairment and infarct volume after permanent and transient middle cerebral artery occlusion in the rat. Stroke. 28, 2060-2065 (1997).
- Hedna, V. S., et al. Validity of Laser Doppler flowmetry in predicting outcome in murine intraluminal middle cerebral artery occlusion stroke. Journal of Vascular and Interventional Neurology. 8 (3), 74-82 (2015).
- Yin, L., et al. Laser speckle contrast imaging for blood flow monitoring in predicting outcomes after cerebral ischemia-reperfusion injury in mice. BMC Neuroscience. 23, 80 (2022).
- Thakkar, P. C., et al. Therapeutic relevance of elevated blood pressure after ischemic stroke in the hypertensive rats. Hypertension. 75 (3), 740-747 (2020).
- Yu, X., Feng, Y., Liu, R., Chen, Q. Hypothermia protects mice against ischemic stroke by modulating macrophage polarization through upregulation of interferon regulatory factor-4. Journal of Inflammation Research. 14, 1271-1281 (2021).
- Denorme, F., Portier, I., Kosaka, Y., Campbell, R. A. Hyperglycemia exacerbates ischemic stroke outcome independent of platelet glucose uptake. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 19, 536-546 (2021).
