בדיקת מיקרוגרעין על דם מלא בהקפאה

לצורך מחקר זה, דגימות דם נאספו על ידי venipuncture מ -30 תורמים בריאים בגילאי 17 עד 65 שנים. נעשה שימוש חוזר בנתוני MN מ -20 תורמים מהמאמר של Beyls et al.8 איסוף דגימות הדם הוא בהתאם להנחיות ועדת האתיקה של בית החולים האוניברסיטאי גנט (מספר רישום:2019/1565), בלגיה. התקבלה הסכמה מדעת בכתב מכל המשתתפים. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים והריאגנטים המשמשים בפרוטוקול זה. 1. איסוף דגימות דם לפני שמתחילים, ודא כי הסכמה מדעת בכתב של המשתתפים זמינה והנחיות אתיות נשמרות כראוי. יש לאסוף דם לתוך צינורות Li-Heparin ולאחסן בטמפרטורת החדר עד שהוא מוכן לעיבוד לצורך שימור בהקפאה. 2. שימור בהקפאה של דם שלם הערה: כל השלבים עד לקצירת תאים מבוצעים באופן אספטי בזרימת אוויר למינרית סטרילית. כדי לשמור בהקפאה 1 מ”ל של דם, לעשות 1 מ”ל של מדיום הקפאה על ידי ערבוב 800 μL של סרום עגל העובר (FCS) ו 200 μL של dimethyl sulfoxide (DMSO).הערה: מדיום ההקפאה מוכן בנפח השווה לדגימות הדם שיש להקפיא. להקפאה של דם שלם, להעביר את דגימת הדם מן הצינור heparinized 15 או 50 מ”ל צינורות צנטריפוגותהערה: קיבולת הצינור תלויה בנפח הדם. מערבלים את הדם במהירות נמוכה עם תוספת רציפה אך טיפתית של נפח שווה של מדיום הקפאה. העבר 2 מ”ל של תערובת הקפאת דם לתוך cryovials (2 מ”ל) שבו כל aliquot יש 1 מ”ל של דגימת דם מעורבב עם 1 מ”ל של תערובת הקפאה. הקפאה הדרגתית הדרגתיתמעבירים את הקריוביאלים לקופסה קריובית המכילה איזופרופנול ומכניסים למקפיא (-80°C) למשך הלילה. העבר את הקריובלים לחנקן נוזלי לשימוש ארוך טווח. 3. הפשרת דם בהקפאה הערה: כדי להגביל את הזמן הכולל של תהליך ההפשרה, יש לטפל במקסימום של 8 קריובלים (2 מ”ל כל אחד) בכל פעם. הכנהיש לחמם מראש 200 מ”ל של מלח סטרילי חוצץ פוספט (PBS) ל-37°C לפני הפשרת הדם. להכין פתרון עבודה של מדיום התרבות הנדרש בתנאים סטריליים. ודא כי בינוני לכל תרבית כולל 1.6 מ”ל של מדיום מלא: Rosewell Park Memorial Institute (RPMI) מדיה בתוספת פניצילין/סטרפטומיצין (0.5%), 0.2 מ”ל של FCS, 20 μL של נתרן פירובט, ו 2 μL של β-mercaptoethanol.הערה: מכיוון שמספר משמעותי של תאי דם יכול ללכת לאיבוד בזמן ההפשרה, הדם המופשר מתורבת בבארות קטנות כמו צלחות 24 בארות בנפח כולל של 2 מ”ל. צלחת אחת מרובת באר לכל מנה משמש. עבור כל תרבית, ציינו היטב את קוד התורם ואת A/B על המכסה יחד עם התאריך והמנה, כפי שמוצע להלן (איור 1). איור 1: פריסה מוצעת של צלחת בת 24 בארות לתרבית דם שלם עבור בדיקת המיקרוגרעין. סמן את הבארות וציין את קודי התורם במקומות המתאימים על המכסה. עבור כל דגימת חולה, בארות כפולות צריכות להיות צמודות זו לזו. שים לב שזוהי פריסה סוגסטיבית עבור קולימטור 10 x 10 וניתן לשנות אותה בהתאם לגודל הקולימטור או הדגימות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. צעדים להפשרה וגידול דם שלםמחממים את אמבט המים ל 37 °C (77 °F). הוציאו את הקריובלים הנדרשים מהחנקן הנוזלי (המספר תלוי בדרישות כגון מספר המנות).הערה: קריוביאל אחד מכיל 1 מ”ל דם ו-1 מ”ל מדיום הקפאה. לכן, שתי תרביות ניתן להגדיר עם דם מ cryovial אחד. הפשירו חלקית את הקריובלים באמבט המים החמים (עד שעדיין יראו גבישי קרח קטנים). הוציאו את הבקבוקונים מאמבט המים ונקו את החלק החיצוני של הבקבוקונים בנייר טישו סטרילי. במכסה מנוע זרימת אוויר למינרי סטרילי , פתח את הבקבוקונים לאט מאוד כדי למנוע מבועות אוויר שנוצרו בתוך הצינורות להישפך החוצה. להשעות מחדש את התוכן של כל בקבוקון ולהעביר אותם בנפרד לצינור צנטריפוגה חרוטי 15 מ”ל (1 צינור לכל בקבוקון). לצינורות המתאימים, הוסף טיפה 1 מ”ל של PBS חם (37 ° C) תוך ערבול עדין של הצינור. השהה מחדש עם פיפטה P1000. לדילול ושטיפה אחידה, יש להוסיף 7 מ”ל PBS שחומם מראש (37°C) ולהשהות מחדש עם פיפטה P1000. צנטריפוגה את הדם במשך 8 דקות ב 180 × גרם (עם הגדרה בהאצה 1, בלם 1) בטמפרטורת החדר. במהלך שלב המתנה זה, מלא את הבארות הריקות (מלבד זו שבה תאים יוגדלו בתרבית) עם 500 μL של PBS. מחזירים את צלחות הבאר לאינקובטור לחימום מוקדם. לאחר השלמת הצנטריפוגה, בזהירות להסיר את supernatant, משאיר מאחור כ 1 מ”ל כדי למנוע הפרעה כדור התא. השהה מחדש את הגלולה בסופרנאטנט שנותר עם פיפטה P1000. הוסף טיפות 8 מ”ל של PBS חם (37 ° C) לתוך הצינורות המתאימים תוך ערבול עדין של הצינורות. לאחר מכן, השהה מחדש עם פיפטה P1000. צנטריפוגה את הדם המושעה למשך 8 דקות ב 180 × גרם (עם הגדרה בהאצה 9, בלם 9). במהלך שלב המתנה זה, העבירו 200 מיקרוליטר של מדיום תרבית לכל אחת מהבארות המסומנות. שמור את הצלחות בחזרה באינקובטור כדי להישאר ב 37 ° C. לאחר הצנטריפוגה, הסירו את הסופרנאטנט בתנועה רציפה (כדי למנוע הפרעה לכדורית התא הרופפת), אך השאירו מאחור כ-80 מיקרוליטר של הסופרנטנט. לכדור, הוסף 280 μL של FCS (טמפרטורת החדר) והשהה מחדש (לנפח כולל של 360 μL). מעבירים 180 μL של תרחיף התא לכל באר ומשהה מחדש (= 0.5 מ”ל של “דם” / תרבית). הנפח הכולל בכל באר הוא כעת 380 μL, והתוצאה היא שכבה בינונית של 2 מ”מ. לדגור את הצלחות באינקובטור CO2 ב 37 ° C לפחות 10 דקות לפני הקרנה. 4. בדיקת G0 MN מוציאים את הצלחות מהאינקובטור ומקרינים את תרבית התאים במינונים נדרשים כגון צילומי רנטגן 0.5, 1 ו-2 Gy (220 kV, 13 mA, 0.15 mm Cu) בטמפרטורת החדר. השתמש בדגימות מוקרנות דמה כבקרות לזיהוי תפוקות MN ספונטניות. מיד לאחר הקרינה, להוסיף 1.62 מ”ל של מדיום תרבית (37 ° C) לכל באר. כדי לעורר את חלוקת התא בלימפוציטים מסוג T, הוסף 40 μL של Phytohemagglutinin (PHA) לכל באר והשהה מחדש ביסודיות. מניחים את הלוחות האלה בחזרה באינקובטור (5% CO2, 37 ° C).הערה: זו תהיה שעת ההתחלה של הבדיקה. חסום את הציטוקינזיס 23 שעות לאחר הגירוי על ידי הוספת 8 μL של ציטוכלסין B (6 מיקרוגרם / מ”ל) לכל באר והשהה מחדש כראוי. קצרו את תרביות התאים 70 שעות לאחר הגירוי/זמן התרבית. השהה מחדש והעבר את התאים לצינור של 15 מ”ל. שטוף כל באר עם 2 מ”ל של PBS והוסף PBS זה לצינור המתאים 15 מ”ל. צנטריפוגה את הצינורות במשך 8 דקות ב 180 × גרם, בטמפרטורת החדר. יש להשליך את הסופרנאטנט אך להשאיר כ-500 מיקרוליטר מעל הכדורית. מערבלים את הגלולה (במלוא המהירות) ותוך כדי מערבולת, מוסיפים באיטיות 2 מ”ל אשלגן כלורי קר (KCl, 4 מעלות צלזיוס). מיד צנטריפוגה את התאים ב 180 × גרם במשך 8 דקות. השליכו את הסופרנטנט, והשאירו בערך 500 מיקרוליטר של הסופרנטנט. מערבלים את הגלולה (במלוא המהירות) ותוך כדי מערבולת, מוסיפים באיטיות 2 מ”ל של קיבוע קר 1 (מתנול/חומצה אצטית/תמיסת רינגר ביחס של 4:1:5). השאר את צינורות הדגימה למשך הלילה ב 4 ° C (מינימום 12 שעות ומקסימום 96 שעות). צנטריפוגה למשך 8 דקות ב 180 × גרם. השליכו את הסופרנטנט. מערבלים את הגלולה (במלוא המהירות) ותוך כדי ערבול, מוסיפים באיטיות 2 מ”ל של קיבוע קר 2 (מתנול/חומצה אצטית ביחס של 4:1). צנטריפוגה למשך 8 דקות ב 180 × גרם. השליכו את הסופרנטנט. מערבלים את הגלולה (במלוא המהירות) ואז מוסיפים לאט (טיפה), תוך כדי מערבולת, 2 מ”ל של קיבוע קר 2 לכדור. השאר את צינורות הדגימה ב 4 ° C (מינימום 12 שעות ומקסימום 96 שעות). נקה את המגלשות עם איזופרופנול ותייג אותן כראוי.הערה: השתמש במדבקות מודפסות כדי לתייג מכיוון שדיו סמן נמחק בקלות במהלך העיבוד. צנטריפוגה את צינורות הדגימה במשך 8 דקות ב 180 × גרם. מעבירים את הסופרנאטנט לצינור אחר כדי לרכז את התאים בהתאם לגודל הכדורית. מערבלים את הכדור. זרוק 40 μL של התאים הקבועים על שקופית יבשה ונקייה. הניחו למגלשות להתייבש בטמפרטורת החדר. אחסנו את השקופיות בקופסה או בכתם מיד לצורך התבוננות. 5. צביעת תפוז אקרידין (AO) טבלו את המגלשות בכתם AO למשך דקה אחת, ולאחר מכן שטפו במהירות את המים המזוקקים, ולאחר מכן, הניחו את המגלשות במאגר פוספט (pH 6.8) למשך דקה אחת. הוציאו את השקופיות מתמיסת החיץ ובעזרת נייר טישו נקי, יבשו את גב המגלשות והניחו את השקופיות על נייר טישו נקי. זרוק 20 μL של חיץ הפוספט על גבי המגלשה וכסה אותו בעדינות עם כיסוי נקי, תוך הימנעות מבועות אוויר. אטמו את המגלשות הללו במלט סיליקון.הערה: מכיוון ש-AO רגיש לאור ודוהה עם הזמן, לקבלת ניגודיות יפה ופלואורסצנטיות, מומלץ להבקיע את השקופיות תוך 5 ימים מרגע הצביעה. יש לאחסן תמיד שקופיות בחדר קר (4°C), כאשר הן אינן נבדקות. 6. ניקוד שקופיות מוכתמות מקם את השקופית תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי ובחן 1,000 תאים דו-חיים (BN). ספירה ידנית של MNs, שהם אחד מששת הסמנים הביולוגיים של רעילות. כדי לעשות זאת, בקש משני קלעים עצמאיים לבחון 500 תאי BN / להחליק תחת אותה הגדלה.הערה: להלן כמה דגשים של קריטריוני הניקוד, כפי שהומלץ על ידי Fenech כדי לתת ניקוד לשקופיות המוכתמות9בחר תא BN על ידי חיפוש תאים מעוגלים יפה עם ציטופלסמה שלמה, עם שני גרעינים מובחנים היטב בערך באותו גודל, צורה רגילה ותבנית צביעה. ודא כי הציטופלסמה של תא BN ניתנת להבחנה מהציטופלסמה של התא הסמוך. ציון MN, וציין כי הוא זהה מורפולוגית לגרעינים הראשיים אך קטן מהם; אפילו MN הגדול ביותר לא יכול להיות יותר מ 1/3 מקוטר הגרעינים הראשיים. ציון MN רק אם הוא אינו נוגע בגרעינים הראשיים או לפחות ניתן להבחין בין הגבול המיקרו-גרעיני לבין גבול הגרעינים הראשיים.