Der Mikronukleus-Assay an kryokonserviertem Vollblut

Für diese Studie wurden Blutproben von 30 gesunden Spendern im Alter zwischen 17 und 65 Jahren durch Venenpunktion entnommen. MN-Daten von 20 Spendern wurden aus der Arbeit von Beyls et al. wiederverwendet.8 Die Entnahme der Blutproben erfolgt in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Ethikkommission des Universitätskrankenhauses Gent (Registrierungsnummer: 2019/1565), Belgien. Von allen Teilnehmern wurde eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt. In der Materialtabelle finden Sie Einzelheiten zu allen Materialien und Reagenzien, die in diesem Protokoll verwendet werden. 1. Entnahme von Blutproben Stellen Sie vor Beginn sicher, dass eine schriftliche Einverständniserklärung der Teilnehmer vorliegt und die ethischen Richtlinien ordnungsgemäß befolgt werden. Sammeln Sie Blut in Li-Heparin-Röhrchen und lagern Sie es bei Raumtemperatur, bis es für die Verarbeitung zur Kryokonservierung bereit ist. 2. Kryokonservierung von Vollblut HINWEIS: Alle Schritte bis zur Zellernte werden aseptisch im sterilen laminaren Luftstrom durchgeführt. Um 1 ml Blut kryokonserviert zu bekommen, stellen Sie 1 ml Gefriermedium her, indem Sie 800 μl fötales Kälberserum (FCS) und 200 μl Dimethylsulfoxid (DMSO) mischen.HINWEIS: Das Gefriermedium wird in einem Volumen hergestellt, das den Blutproben entspricht, die eingefroren werden müssen. Für die Kryokonservierung von Vollblut wird die Blutprobe aus dem heparinisierten Röhrchen in 15- oder 50-ml-Zentrifugenröhrchen überführtHINWEIS: Das Fassungsvermögen des Röhrchens hängt vom Volumen des Blutes ab. Das Blut mit niedriger Geschwindigkeit vorwirbeln, wobei kontinuierlich, aber tropfenweise ein gleiches Volumen des Gefriermediums zugegeben wird. 2 ml Blutgefriermischung in Kryoröhrchen (2 ml) überführen, wobei jedes Aliquot 1 ml Blutprobe mit 1 ml Gefriermischung vermischt hat. Schrittweise schrittweises EinfrierenKryoröhrchen in eine Kryobox mit Isopropanol umfüllen und über Nacht in einen Gefrierschrank (-80 °C) stellen. Füllen Sie die Kryoröhrchen für den Langzeitgebrauch in flüssigen Stickstoff um. 3. Auftauen von kryokonserviertem Blut HINWEIS: Um die Gesamtzeit des Auftauvorgangs zu begrenzen, sollten maximal 8 Kryoröhrchen (je 2 ml) gleichzeitig gehandhabt werden. Präparat200 ml sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) auf 37 °C vorwärmen, bevor das Blut aufgetaut wird. Bereiten Sie eine Arbeitslösung des benötigten Nährmediums unter sterilen Bedingungen vor. Stellen Sie sicher, dass das Medium pro Kultur 1,6 ml des vollständigen Mediums enthält: Medien des Rosewell Park Memorial Institute (RPMI), ergänzt mit Penicillin/Streptomycin (0,5 %), 0,2 ml FCS, 20 μl Natriumpyruvat und 2 μl β-Mercaptoethanol.HINWEIS: Da beim Auftauen eine beträchtliche Anzahl von Blutzellen verloren gehen kann, wird das aufgetaute Blut in kleinen Vertiefungen wie 24-Well-Platten mit einem Gesamtvolumen von 2 ml kultiviert. Es wird eine Multi-Well-Platte pro Dosis verwendet. Geben Sie für jede Kulturvertiefung den Spendercode und A/B auf dem Deckel zusammen mit dem Datum und der Dosis an, wie unten vorgeschlagen (Abbildung 1). Abbildung 1: Vorgeschlagenes Layout einer 24-Well-Platte zur Kultivierung von Vollblut für den Mikronukleus-Assay. Markieren Sie die Vertiefungen und geben Sie die Spendercodes an den entsprechenden Stellen auf dem Deckel an. Für jede Patientenprobe sollten doppelte Wells nebeneinander liegen. Beachten Sie, dass es sich um ein suggestives Layout für einen 10 x 10-Kollimator handelt, das je nach Größe des Kollimators oder der Proben geändert werden kann. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Schritte zum Auftauen und zur Kultivierung von VollblutDas Wasserbad auf 37 °C erwärmen. Entnehmen Sie die benötigten Kryoröhrchen aus dem flüssigen Stickstoff (die Anzahl hängt von den Anforderungen ab, wie z. B. der Anzahl der Dosen).HINWEIS: Ein Kryoröhrchen enthält 1 ml Blut und 1 ml Gefriermedium. Daher können zwei Kulturen mit Blut aus einem Kryoröhrchen eingerichtet werden. Die Kryoröhrchen im warmen Wasserbad teilweise auftauen (bis noch kleine Eiskristalle zu sehen sind). Nehmen Sie die Fläschchen aus dem Wasserbad und reinigen Sie die Außenseite der Fläschchen mit sterilem Seidenpapier. Öffnen Sie die Durchstechflaschen in einer sterilen Laminar-Airflow-Haube sehr langsam, um zu verhindern, dass Luftblasen, die sich in den Röhrchen gebildet haben, heraustreten. Resuspendieren Sie den Inhalt jeder Durchstechflasche und geben Sie ihn einzeln in ein konisches 15-ml-Zentrifugenröhrchen (1 Röhrchen pro Durchstechflasche). In die jeweiligen Röhrchen tropfenweise 1 ml warmes (37 °C) PBS geben, während das Röhrchen vorsichtig geschwenkt wird. Resuspendieren Sie mit einer P1000-Pipette. Zur Verdünnung und gleichmäßigen Wäsche tropfenweise 7 ml vorgewärmtes PBS (37 °C) zugeben und mit einer P1000-Pipette resuspendieren. Das Blut wird 8 min bei 180 × g (mit Einstellung auf Beschleunigung 1, Bremse 1) bei Raumtemperatur zentrifugiert. Während dieses Warteschritts füllen Sie die leeren Vertiefungen (mit Ausnahme derjenigen, in der die Zellen kultiviert werden) mit 500 μl PBS. Legen Sie die Well-Platten zum Vorwärmen zurück in den Inkubator. Sobald die Zentrifugation abgeschlossen ist, entfernen Sie vorsichtig den Überstand und lassen Sie ca. 1 ml zurück, um das Zellpellet nicht zu stören. Resuspendieren Sie das Pellet mit einer P1000-Pipette im verbleibenden Überstand. Tropfenweise 8 ml warmes PBS (37 °C) in die jeweiligen Röhrchen geben und dabei die Röhrchen vorsichtig schwenken. Anschließend mit einer P1000-Pipette resuspendieren. Das resuspendierte Blut wird 8 min bei 180 × g zentrifugiert (mit Einstellung auf Beschleunigung 9, Bremse 9). Während dieses Warteschritts werden 200 μl Nährmedium in jede der markierten Vertiefungen überführt. Bewahren Sie die Platten wieder im Inkubator auf, damit sie bei 37 °C bleiben. Nach der Zentrifugation wird der Überstand in einer kontinuierlichen Bewegung entfernt (um eine Störung des losen Zellpellets zu vermeiden), aber ca. 80 μl des Überstandes zurückgelassen. Dem Pellet 280 μl FCS (Raumtemperatur) hinzufügen und resuspendieren (auf ein Gesamtvolumen von 360 μl). 180 μl der Zellsuspension in jede Vertiefung überführen und resuspendieren (= 0,5 ml “Blut”/Kultur). Das Gesamtvolumen in jeder Vertiefung beträgt nun 380 μl, was zu einer 2 mm dicken Mittelschicht führt. Die Platten werden vor der Bestrahlung mindestens 10 min in einemCO2-Inkubator bei 37 °C inkubiert. 4. G0 MN-Assay Nehmen Sie die Platten aus dem Inkubator und bestrahlen Sie die Zellkultur mit den erforderlichen Dosen wie 0,5, 1 und 2 Gy Röntgenstrahlen (220 kV, 13 mA, 0,15 mm Cu) bei Raumtemperatur. Verwenden Sie scheinbestrahlte Proben als Kontrollen, um spontane MN-Ausbeuten zu identifizieren. Unmittelbar nach der Bestrahlung werden 1,62 ml Nährmedium (37 °C) in jede Vertiefung gegeben. Um die Zellteilung in T-Lymphozyten zu stimulieren, fügen Sie 40 μl Phytohämagglutinin (PHA) in jede Vertiefung hinzu und resuspendieren Sie gründlich. Stellen Sie diese Platten wieder in den Inkubator (5% CO2, 37 °C).HINWEIS: Dies ist die Startzeit des Assays. Blockieren Sie die Zytokinese 23 Stunden nach der Stimulation, indem Sie 8 μl Cytochalasin B (6 μg/ml) pro Vertiefung hinzufügen und ordnungsgemäß resuspendieren. Entnehmen Sie die Zellkulturen 70 Stunden nach der Stimulation/Kulturzeit. Resuspendieren Sie die Zellen und überführen Sie sie in ein 15-ml-Röhrchen. Spülen Sie jede Vertiefung mit 2 ml PBS aus und geben Sie dieses PBS in das entsprechende 15-ml-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Röhrchen 8 Minuten lang bei 180 × g bei Raumtemperatur. Den Überstand verwerfen, aber ca. 500 μl über dem Pellet lassen. Das Pellet bei voller Geschwindigkeit vortexen und während des Vortexens langsam 2 ml kaltes Kaliumchlorid (KCl, 4 °C) tropfenweise hinzufügen. Die Zellen werden sofort bei 180 × g für 8 min zentrifugiert. Verwerfen Sie den Überstand, wobei ca. 500 μl des Überstandes übrig bleiben. Das Pellet (bei voller Geschwindigkeit) vortexen und während des Vortexens langsam 2 ml kaltes Fixiermittel 1 (Methanol/Essigsäure/Ringerlösung in einem Verhältnis von 4:1:5) tropfenweise hinzufügen. Lassen Sie die Probenröhrchen über Nacht bei 4 °C (mindestens 12 h und maximal 96 h) stehen. 8 min bei 180 × g zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand. Das Pellet (bei voller Geschwindigkeit) vortexen und während des Vortexens langsam 2 ml kaltes Fixiermittel 2 (Methanol/Essigsäure im Verhältnis 4:1) tropfenweise hinzufügen. 8 min bei 180 × g zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand. Das Pellet (bei voller Geschwindigkeit) vortexen und dann langsam (tropfenweise) während des Vortexens 2 ml kaltes Fixiermittel 2 in das Pellet geben. Lassen Sie die Probenröhrchen bei 4 °C (mindestens 12 h und maximal 96 h). Reinigen Sie die Objektträger mit Isopropanol und beschriften Sie sie ordnungsgemäß.HINWEIS: Verwenden Sie gedruckte Aufkleber zum Beschriften, da sich die Markertinte während der Verarbeitung leicht abwischen lässt. Die Probenröhrchen werden 8 min bei 180 × g zentrifugiert. Füllen Sie den Überstand in ein anderes Röhrchen, um die Zellen entsprechend der Größe des Pellets zu konzentrieren. Wirbeln Sie das Pellet vor. Tropfen Sie 40 μl der fixierten Zellen auf einen trockenen und sauberen Objektträger. Lassen Sie die Objektträger bei Raumtemperatur trocknen. Bewahren Sie die Objektträger sofort zur Beobachtung in einer Schachtel oder einem Fleck auf. 5. Färbung von Acridinorange (AO) Tauchen Sie die Objektträger 1 Minute lang in AO-Färbung, gefolgt von einer kurzen Wäsche im destillierten Wasser und legen Sie die Objektträger dann für 1 Minute in Phosphatpuffer (pH 6,8). Nehmen Sie die Objektträger aus der Pufferlösung und mit sauberem Seidenpapier heraus, trocknen Sie die Rückseite der Objektträger ab und legen Sie die Objektträger auf ein sauberes Seidenpapier. Tropfen Sie 20 μl des Phosphatpuffers auf den Objektträger und decken Sie ihn vorsichtig mit einem sauberen Deckglas ab, um Luftblasen zu vermeiden. Versiegeln Sie diese Objektträger mit Silikonzement.HINWEIS: Da AO lichtempfindlich ist und mit der Zeit verblasst, wird für einen schönen Kontrast und Fluoreszenz empfohlen, die Objektträger innerhalb von 5 Tagen nach der Färbung zu ritzen. Objektträger immer in einem kühlen Raum (4 °C) lagern, wenn sie nicht untersucht werden. 6. Einritzen von gefärbten Objektträgern Legen Sie Ihren Objektträger unter ein Fluoreszenzmikroskop und untersuchen Sie 1.000 zweikernige Zellen (BNs). Zählen Sie MNs manuell, die einer der sechs Biomarker für Toxizität sind. Lassen Sie dazu zwei unabhängige Scorer 500 BN-Zellen/Objektträger unter der gleichen Vergrößerung untersuchen.HINWEIS: Im Folgenden finden Sie einige Highlights der Bewertungskriterien, die von Fenech empfohlen wurden, um die gefärbten Objektträgerzu bewerten 9Wählen Sie eine BN-Zelle aus, indem Sie nach schön abgerundeten Zellen mit intaktem Zytoplasma suchen, mit zwei gut unterschiedenen Kernen von ungefähr gleicher Größe, regelmäßiger Form und Färbung. Stellen Sie sicher, dass das Zytoplasma der BN-Zelle vom Zytoplasma der benachbarten Zelle unterscheidbar ist. Bewerten Sie ein MN und beachten Sie, dass es morphologisch identisch mit den Hauptkernen ist, aber kleiner als diese; selbst der größte MN kann nicht mehr als 1/3 des Durchmessers der Hauptkerne betragen. Ein MN wird nur dann gewertet, wenn es die Hauptkerne nicht berührt oder zumindest die mikronukleare Grenze von der Grenze der Hauptkerne unterscheidbar ist.