通过将微流体与质量光度法相结合来分析微摩尔浓度下的蛋白质复合物形成

1. 准备仪器并启动软件 在开始任何测量之前，打开质量光度计并保持打开至少 1 小时。注意： 这是因为仪器需要达到恒定温度。不让质量光度计开启 1 小时可能会导致质量位移，因此导致结果不准确。 通过打开电源并按下隔离按钮（在质量光度计下方）来打开防振台。振动限制了质量亮度测量仪器的性能，因此防振台对于确保仪器的最大灵敏度非常重要。打开微流控盒。 启动数据采集软件和微流控控制软件。打开空气压缩机。 2. 制备蛋白质样品、缓冲液和清洁溶液 将 200 mL PBS （pH 7.4） 缓冲液加入干净的 200 mL 瓶中，将 200 mL PBS （pH 5.0） 缓冲液加入第二个 200 mL 瓶中。注意：在接下来的步骤中，需要将 200 mL 瓶子连接到“L”流量单位传感器。使用 pH 7.4 PBS 缓冲液进行校准测量，使用 pH 5.0 PBS 缓冲液进行样品测量。 在 0.5 mL 离心管中，以 1：10 的比例混合 IgG （2 μM） 和 FcRn （20 μM），总体积为 60 μL。FcRn和IgG的储备溶液分别为91.9μM和13.5μM。通过在离心管中混合 9 μL 储备 IgG + 13 μL 储备 FcRn + 38 μL PBS（pH 5.0，室温 [RT]）来制备反应物，总体积为 60 μL。两种反应物的最终浓度分别为IgG的2μM和FcRn的20μM。 在此过程中，将所有蛋白质储备液保持在冰上。 在另一个 0.5 mL 离心管中，分配 20 μL 浓度为 20 μM 的 β-淀粉酶校准品。例如，要制备此处使用的β-淀粉酶校准品，请按照2.3.1.1-2.3.1.2中描述的程序进行操作。将20mg β-淀粉酶粉末重悬于3.57mL PBS（5%甘油）中，对应于5.6mg / mL，摩尔浓度为100μM（分子量为56kDa）。 要稀释至 20 μM，将 200 μL 的 100 μM 原液与 800 μL PBS（pH 7.4，RT）混合在 1 mL 离心管中。 将样品在室温下孵育至少 30 分钟。注意：打开质量光度计后，开始准备样品和校准剂稀释度。对于该实验，将样品孵育120分钟。 在三个 50 mL 离心管中，等分试样：50 mL PBS （pH 7.4） – 清洗溶液 1 （CS1）、50 mL 0.5 M NaOH – 清洗溶液 2 （CS2） 和 50 mL 100% IPA – 清洗溶液 3 （CS3）。 3. 实验设置 要加载样品和校准品，请将校准离心管放置在微流体盒的位置 4 处，将样品离心管放置在微流体盒的位置 5（图 1）。 要加载清洁溶液，请将 CS1、CS2 和 CS3 放置在微流体盒的位置 1、2 和 3（图 1）。注意：样品、校准品和清洁溶液连接到多路开关（m 开关）。m 开关连接到“S”流量单元传感器。 将连接到缓冲管路的盖子拧到 200 mL （pH 7.4） 缓冲液瓶上。注意： 缓冲管路连接到截止阀，截止阀连接到“L”流量单元传感器。截止阀可防止在缓冲液流动停止时可能发生的任何虹吸效应。虹吸可导致稀释的残余液体返回缓冲液储液槽，从而污染缓冲液。 将微流控芯片放在制备板上。将“S”流量单元传感器的另一端推入微流控芯片中第一个通道的“样品入口”（图1）。样品线已完成。 将“L”流量单元传感器的另一管端推入微流控芯片中第一个通道的“缓冲入口”（图1）。缓冲线已完成。 为了收集流出物，将一根管子推到微流控芯片中第一个通道的“出口”;放置另一端，使其排入废物容器瓶或烧杯中（图 1）。 4. 用缓冲液灌注样品和缓冲液管路 打开缓冲管路上的手动截止阀。 在微流控控制软件中，将缓冲管路流速设置为 1000 μL/min，并确保缓冲管路压力不超过 110 mbar（图 2）。流动将自动在缓冲管路中开始（图 1）。注意： 如果缓冲管路压力超过 110 mbar，可能是由于空气通过流量传感器。如果压力在几秒钟内没有恢复正常，则可能是堵塞（通常是由于连接处的管道被挤压）。在这种情况下，停止流动并检查缓冲管路中的连接，从截止阀开始。 在微流控控制软件中，选择 m 开关的位置 1（对应于 PBS 缓冲液），然后将样品管路流速设置为 8 μL/min，并确保样品管路压力不超过 350 mbar。流动将自动在采样管路中开始（图 1）。 使用移液器吸头（或其他软塑料组件）从上方轻轻按压，靠近被困在芯片中的气泡，以去除气泡并确保它们通过出口排出。注意： 确保清除正在使用的通道的“混合器”和“观察区域”（图 1）部分中的所有气泡。注意不要用力过猛，因为这可能会损坏芯片。 5. 将微流控芯片放在质量光度计上并找到焦点 在质量光度计的物镜上滴一滴显微镜浸油。 将微流体芯片放在质量光度计的支架上，使“样品入口”朝上，并将其连接到载物台夹上（图1）。确保所有管道连接保持连接。 使用数据采集软件移动载物台，确保通道 1 的“观察区域”与物镜对齐（图 1）。 关闭质量光度计盖，然后按下数据采集软件中的 “液滴稀释查找焦点 ”选项。 检查数据采集软件左下角的白色对焦环（图3）。环中的间隙表明浸油中存在气泡;通过将载物台速度提高到最大并轻轻地横向移动载物台来消除这一点。 对焦完成后，等待 2-3 分钟，然后再进行第一次录音。然后，按 Record 记录 1 分钟的测量值，并确保（通过观察测量值）没有出现杂质。注意：杂质可能位于玻璃表面或缓冲液中。数据采集软件中的锐度值应在4.5%以上。 6. 质量光度法校准 在微流控控制软件中，将 m 开关切换到位置 4（对应于校准品），并确保样品管路流速设置为 8 μL/min，样品管路压力不超过 350 mbar（图 2）。校准剂将开始流经芯片。等待大约 1.5-2.5 分钟（或直到在数据采集软件上一致地看到校准品）。时间可能因样品管路长度而异。 一旦一致地看到校准品（即，事件数量足以进行准确的质量光度测量），在微流体控制软件中，将流速降低至 0.5 μL/min（该实验的目标稀释水平）。注意：从更高的流速开始，可以减少校准剂到达芯片所需的时间。 确保没有“太少”或“太多”的分子落在测量表面上（图4）。如果着陆事件密度不是“理想”（图4），请在微流体控制软件中更改流速。如果事件密度太低，则增加样品流速，直到观察到分离良好的着陆事件（但不要超过 8 μL/min）。如果过高，请降低样品流速（但不要低于 0.1 μL/min）。 如果样品管中的校准剂体积不足，请将 m 开关位置更改为 PBS pH 7.4 线（位置 1）以避免注入空气。 按 Record 并进行 60 秒测量。将文件保存在选定的文件夹中。注意：数据采集软件生成扩展名为 .mp 的文件。 7. 清洁样品管路并停止流动 在微流体控制软件中，切换到 m 开关的位置 2，并将样品压力更改为 800 mbar（图 2）。用 CS2 （NaOH） 冲洗系统 4 分钟。 切换到 m 开关的位置 3，然后用 CS3 （IPA） 冲洗系统 4 分钟。 切换到 m 开关的位置 1，用 CS1 （PBS） 冲洗系统 4 分钟。 在微流体控制软件中，通过将样品管路和缓冲管路压力设置为 0 并关闭缓冲阀来停止所有流量。 断开芯片与载物台的连接，然后将其放回制备板上。断开所有管子，并将样品管子末端放入废液瓶中。用异丙醇和湿巾清洁物镜。 8. 测量质量光度法样品 拧下连接到 200 mL （pH 7.4） 缓冲液瓶的盖子，然后将其拧到 200 mL （pH 5.0） 缓冲液瓶上。 重复步骤 3.4-5.6，但使用芯片的第二个通道而不是第一个通道。 在微流控控制软件中，将m开关切换到位置5（对应样品），将样品管路流速设置为8μL/min，并确保样品管路压力不超过350 mbar（图2）。 重复步骤 6.2-6.4 测量样品。要计算要使用的流速，请确保流速的倍数差与所需的样品稀释因子相匹配。例如，为了在这里实现 2000 倍的稀释，流速相差 2000 倍;缓冲液流速为1000 μL/min，样品流速为0.5 μL/min。在实验结束时，请始终按照清洁协议保持管路清洁。 9. 数据分析 数据采集完成后，启动数据分析软件（图 5）。 单击左上角的加号 （+） 图标，然后选择 .mp 校准文件。软件将开始分析加载的文件。根据测量的大小和数量，这可能需要几分钟使用数据采集软件采集数据时，请勿在数据分析软件中分析 .mp 文件，因为这样做可能会降低采集数据的质量。 按下 创建质量校准 按钮（右下角）。将打开一个对话框，其中显示了一个表格，其中填充了拟合峰的对比度值。 将值更改为拟合峰的已知质量值（对于β淀粉酶，这些值为 56 kDa、112 kDa 和 224 kDa），然后按 保存。新创建的校准文件（.mc 扩展名）将出现在 质量校准 面板（数据分析软件的左下角）（图 6）。 单击左上角的加号 （+） 图标，然后选择 .mp 示例文件。 要创建质量直方图， 如图 5 所示，请转到 Analysis 选项卡，选择 Histogram 模式和 Mass 绘图选项。根据需要调整 Bin 宽度、质量限制和其他参数。 如果需要，在导出图表和/或将整个工作区另存为.dmp文件之前，请在 “图表 ”选项卡中进一步自定义绘图。