تحليل تكوين مركب البروتين بتركيزات ميكرومولار عن طريق اقتران الموائع الدقيقة بالقياس الضوئي الشامل
概要
يجمع هذا البروتوكول بين القياس الضوئي الشامل ونظام الموائع الدقيقة الجديد للتحقيق في تفاعلات البروتين والبروتين منخفضة التقارب. يعتمد هذا النهج على التخفيف السريع للمعقدات عالية التركيز في المحلول ، مما يتيح قياسات منخفضة التقارب ويوسع إمكانية تطبيق القياس الضوئي الشامل.
Abstract
القياس الضوئي الشامل هو تقنية متعددة الاستخدامات لقياس الكتلة تتيح دراسة التفاعلات الجزيئية الحيوية والتكوين المعقد في محلول بدون ملصقات. القياس الضوئي الشامل مناسب بشكل عام لتحليل العينات في نطاق تركيز 100 pM-100 nM. ومع ذلك ، في العديد من النظم البيولوجية ، من الضروري قياس عينات أكثر تركيزا لدراسة التفاعلات منخفضة التقارب أو العابرة. نوضح هنا طريقة توسع بشكل فعال نطاق تركيزات العينات التي يمكن تحليلها عن طريق القياس الضوئي الشامل من nanomolar إلى عشرات micromolar.
في هذا البروتوكول ، يتم دمج القياس الضوئي الشامل مع نظام الموائع الدقيقة الجديد للتحقيق في تكوين مجمعات البروتين في محلول في نطاق تركيز المولر الدقيق. مع نظام الموائع الدقيقة ، يمكن للمستخدمين الاحتفاظ بعينة بتركيز أعلى مرغوب فيه متبوعا بالتخفيف إلى النطاق النانوي – عدة أجزاء من الثانية قبل قياس القياس الضوئي الشامل. بسبب سرعة التخفيف ، يتم الحصول على البيانات قبل تحول توازن العينة (أي تفكك المجمع).
يتم تطبيق هذه التقنية لقياس التفاعلات بين الجسم المضاد للغلوبولين المناعي G (IgG) ومستقبل Fc الوليدي ، مما يدل على تكوين معقدات عالية الترتيب لم تكن قابلة للقياس الكمي باستخدام قياسات القياس الضوئي للكتلة الثابتة.
في الختام ، فإن الجمع بين القياس الضوئي الشامل والموائع الدقيقة يجعل من الممكن توصيف العينات في نطاق تركيز المولر الدقيق وهو بارع في قياس التفاعلات الجزيئية الحيوية مع الصلات الأضعف. يمكن تطبيق هذه القدرات في مجموعة من السياقات – بما في ذلك تطوير وتصميم العلاجات الحيوية – مما يتيح توصيفا شاملا للتفاعلات المتنوعة بين البروتين والبروتين.
Introduction
تؤكد تفاعلات البروتين والبروتين على معظم الوظائف الخلوية ، من التنظيم المناعي إلى تكرار الحمض النووي وترجمته. نتيجة لذلك ، هناك حاجة أساسية في جميع أنحاء علوم الحياة للتحقيق في مجموعة واسعة من التفاعلات عبر المجمعات غير المتجانسة المتنوعة التي تتشكل بشكل شائع. ومع ذلك ، غالبا ما يكون اكتشافها وتوصيفها وقياسها أمرا صعبا ، خاصة بالنسبة للتفاعلات منخفضة التقارب1.
غالبا ما تستخدم مقايسات الترسيب المناعي للكشف عن التفاعلات عالية التقارب ، ولكن بالنسبة للتفاعلات منخفضة التقارب والتفاعلات العابرة ، يكون الكشف غير ممكن إلى حد كبير2. يمكن أيضا استخدام تقنيات التألق ولكنها تتطلب إضافةملصقات الفلورسنت 2. يمكن أن يوفر Cryo-EM لقطة هيكلية وقراءة جماعية لمجمعات البروتين المتكونة بدقة مكانية عالية ولكنه يتطلب أيضا العمل بتركيزات منخفضة جدا لتصوير تفاعلات منخفضة التقارب. يجلب Cryo-EM أيضا تحديات تتعلق بالتكلفة وإمكانية الوصول وإعداد العينات ووقت التحليل3.
بالإضافة إلى ذلك ، أصبح رنين البلازمون السطحي (SPR) طريقة شائعة لتحديد تفاعلات البروتين والبروتين ، على الرغم من أنه يتطلب تجميد البروتين ، والذي يمكن أن يؤثر على توازن الربط ويؤدي إلى معدلات متغيرة ، وبالتالي تقليل دقة القياس 4,5. كما يتضمن العديد من خطوات الفحص قبل جمع البيانات وتحليلها6.
القياس الضوئي الشامل هو تقنية أحادية الجزيء تم استخدامها لتحليل تفاعلات البروتينوالبروتين 5،6،7. وهو يعمل عن طريق قياس كتلة الجزيئات أو المجمعات المفردة بناء على الضوء الذي تشتت عند هبوطها على سطح غطاء زجاجي8. تم استخدام قياسات القياس الضوئي الشامل لتحديد تقارب الارتباط من الوفرة النسبية لشركاء الربط والمعقدات التي يشكلونها5. ومع ذلك ، مثل تقنيات الجزيء الواحد الأخرى ، يجب أن يكون تركيز العينة المراد قياسها عادة أقل من 100 نانومتر. إذا كان التركيز أعلى ، فإن الجزيئات التي تهبط على السطح الزجاجي سوف تتداخل مكانيا ، مما يؤدي إلى رداءة جودة البيانات7. وبالتالي ، لا يمكن قياس التفاعلات الأضعف (KD ~ micromolars) ، التي تنفصل عند هذه التركيزات المنخفضة ، بشكل موثوق لأنه لا يمكن ملاحظة الخليط الضروري من الأنواع غير المنضمة والمقيدة5.
هنا ، نصف نهجا يتغلب على هذا القيد بناء على جهاز قياس ضوئي جديد مقترن بالموائع الدقيقة. على وجه التحديد ، يتم استخدام نظام الموائع الدقيقة مع مقياس الضوء الشامل لتوسيع نطاق التفاعلات التي يمكن قياسها كميا عن طريق القياس الضوئي الشامل. لقد ثبت أن علم الموائع الدقيقة يوفر مجموعة من الاحتمالات للتحقيق في تفاعلات البروتين والبروتين ، بما في ذلك التخفيف السريع للكشف عن التفاعلات الضعيفة 1,9. يعمل النظام الموصوف هنا عن طريق تخفيف العينة بسرعة تصل إلى 10000 ضعف على شريحة الموائع الدقيقة وتدفقها على الفور عبر منطقة مراقبة الرقاقة ، مما يتيح قياس القياس الضوئي الشامل أن يبدأ في غضون 50 مللي ثانية من وقت بدء الجزيئات عملية التخفيف10. يحدث التخفيف عندما يتم دمج العينة والمخزن المؤقت في خلاط صمام Tesla عكسي على الشريحة ، مع تحديد معدلات التدفق النسبية للمحلولين مقدار التخفيف الذي يحدث (انظر البروتوكول الخطوة 8). يمكن التحكم في معدل التدفق باستخدام برنامج التحكم في الموائع الدقيقة. يمكن أن يؤدي تغيير معدل التدفق إلى تغيير عدد السكان النسبي للأنواع لأنه يمكن أن يؤثر على عدد أحداث الهبوط على سطح الزجاج ، وهو ما يقيسه مقياس الكتلة الضوئي.
سرعة العملية سريعة بما يكفي لإكمال القياس قبل تعطيل سلامة التفاعل (لمزيد من التفاصيل ، انظر أيضا المناقشة). يمكن فهم ذلك من خلال إلقاء نظرة سريعة على نظرية التفاعلات من الدرجة الأولى ، حيث 
. ثابت معدل الاقتران الأمامي هو kf ، وثابت معدل التفكك الخلفي هو kb ، ويتم تعريف ثابت تفكك التوازن (KD) على أنه
كد = كب / كو
بالنسبة لربط البروتين ، يكون kfمحدودا بشكل عام بانتشار المواد المتفاعلة11 وبالتالي يقتصر على نطاق 106-10 7 M-1 · s-1. نظرا لأن نطاق محدود ، فإن تفاعل التقارب المنخفض (KD ~ micromolars) سيكون له kb≈ 1 s-1. أي أن kb = kf · KD = (106 M-1 · s-1) (10-6 M) = 1 s-1 ، مع عمر النصف للمجمع حوالي 0.7 s11,12.
نظام المثال الخاص بنا هو ربط الجسم المضاد أحادي النسيلة IgG trastuzumab بالمجال القابل للذوبان لمستقبل IgG حديثي الولادة Fc (FcRn) ، وهما شريكان متفاعلان معروفان13. أظهرت البيانات المنشورة سابقا التي تم الحصول عليها باستخدام القياس الضوئي الشامل التقليدي وحده (أي مع التخفيف اليدوي للعينات) أن البروتينات تشكل أنواعا متعددة. كانت مونومرات FcRn وثنائيات FcRn و IgG غير المنضمة مرئية بوضوح ، بينما تم اكتشاف معقدات IgG-FcRn (بنسب 1: 1 و 1: 2) (عند الرقم الهيدروجيني 5.0) ولكن فقط بوفرة منخفضة جدا5. تثير هذه الملاحظة مسألة ما إذا كان يمكن اكتشاف تكوين مركب IgG-FcRn بشكل أكثر وضوحا إذا تم قياسه بتركيز أعلى. في الواقع ، فإن الجمع بين القياس الضوئي الشامل ونهج التخفيف السريع المقترن الموصوف هنا قدم دليلا أكثر قوة على التكوين المعقد من خلال زيادة جزيئاتها المقاسة.
يتيح بروتوكول القياس الضوئي الشامل وعلم الموائع الدقيقة الموصوف هنا توصيف تكوين المجمعات مع KD حتى نطاق المولار. سيتطلب التحديد التجريبي ل KD مزيدا من التحسينات على دقة مستشعر التدفق ، واستقرار المضخة ، والاختلافات من شريحة إلى شريحة ، وموقع القياس داخل نافذة المراقبة ، حيث ستؤثر كل هذه العوامل على الوقت من وقت تخفيف العينة إلى قياسها.
يمكن تطبيق نفس النهج للتحقق من الارتباط بين أي بروتينات قابلة للذوبان ، بشرط أن يكون لها أوزان جزيئية مميزة (مفصولة بما لا يقل عن 25 كيلو دالتون) تقع في النطاق المناسب للتحليل باستخدام مقياس ضوئي للكتلة (30 كيلو دالتون إلى 6 ميجا فولت أمبير). يمكن أن تكون الأفكار التي تم الحصول عليها مفيدة للدراسات في مجموعة من السياقات – من اكتساب فهم ميكانيكي للوظائف الخلوية إلى تصميم أدوية علاجية حيوية جديدة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يوفر البروتوكول الموضح هنا طريقة للكشف عن التفاعلات البروتينية منخفضة التقارب وقياسها. يستخدم مقياس ضوئي كتلي مقترن بنظام الموائع الدقيقة سريع التخفيف. القياس الضوئي الشامل هو أداة تحليلية حيوية خالية من الملصقات يمكنها قياس الكتلة الجزيئية بشكل موثوق في محلول للجزيئات الحيوية16 ، لأولئك الذين يقعون في نطاق 30 كيلو دالتون إلى 6 ميجا فولت أمبير. نظرا لأن القياس الضوئي الشامل هو تقنية أحادية الجزيء تحلل العينات واحدة تلو الأخرى ، فإنها تقتصر عموما على العينات في نطاق تركيز 100 pM-100 nM. فوق هذا النطاق ، سوف تتداخل الجزيئات التي تهبط على السطح الزجاجي مكانيا ، مما يؤدي إلى رداءة جودة البيانات ؛ تحت هذا النطاق ، يتم الحصول على القليل جدا من البيانات لإجراء تحليل قوي7. والنتيجة المهمة هي أنه يمكن أن يقصر التحقيق في تفاعلات البروتين على تلك التي تشكل مزيجا من الأنواع المقيدة وغير المرتبطة ضمن هذا النطاق.
هنا ، قمنا بتفصيل بروتوكول خطوة بخطوة لاستخدام نظام الموائع الدقيقة للتخفيف السريع لتوسيع نطاق تركيزات العينات القابلة للقياس الضوئي الشامل بشكل فعال. من خلال تخفيف العينة على رقاقة الموائع الدقيقة ثم تدفقها عبر نافذة مراقبة الكاشف في غضون 50 مللي ثانية ، يلتقط النظام المعقدات الموجودة في العينة غير المخففة قبل أن يتحول توازن التفاعل. يتم تسليم العينة باستمرار إلى الكاشف أثناء القياسات الفردية. في ظل هذه الظروف ، سيبقى 95٪ من المجمع سليما عند قياس العينة ، حتى بالنسبة للتفاعلات منخفضة التقارب – مع KD بترتيب الأضراس الدقيقة ومعدلات التفكك بسرعة 1 s-1.
يمكن حساب ذلك على النحو التالي: بالنسبة للتفاعل بمعدل أمامي kfومعدل خلفي kb ،
عند الاتزان ، تظل تركيزات الأنواع الثلاثة (A و B و AB المركبة) ثابتة ، لذلك 
و 
. في ظل الافتراض المحافظ بأن الاضطراب (التخفيف ، في هذه الحالة) قد يتسبب في تفكك المركب ، لكن رد الفعل الأمامي (الارتباط) لا يستمر ، يمكن التعامل مع المصطلح kf [A] [B] على أنه لا يكاد يذكر ، ويمكن إجراء التبسيط التالي:
يعطي التكامل التعبير التالي لتركيز المركب في الوقت المناسب بعد اضطراب التوازن:
جزء المركب الذي يظل مقيدا في الوقت t بعد اضطراب التوازن هو:
عند = 50 مللي ثانية ، للتفاعل مع kb≈ 1 s-1 ، يكون الكسر المرتبط 0.95 ، أو 95٪ 11,12.
تم استخدام القياس الضوئي الشامل هنا وسابقا5 للتحقيق في ارتباط الجسم المضاد أحادي النسيلة IgG trastuzumab بالمجال القابل للذوبان في FcRn. تم الإبلاغ عن ارتباط الشريكين الملزمين بتقارب نانوي عند الرقم الهيدروجينيالحمضي 17. تم استخدام القياس الضوئي الشامل لتقييم نوعي لوفرة المعقدات التي تشكلت بينما كان شركاء الربط عند الرقم الهيدروجيني 5.0 ، وتم تخفيف العينات بسرعة من خلال نظام الموائع الدقيقة الإضافي. تم تحسين الإجراء لتفاعل البروتين والبروتين المعين بناء على النتائج المبلغ عنهاسابقا 5. يمكن استخدام نفس الإجراء لدراسة التفاعلات الأخرى ، بشرط أن يكون لدى المستخدمين معرفة مسبقة أو تحسين الظروف التجريبية للنظام المعني ، مثل المخازن المؤقتة التي يجب استخدامها ، وتركيز البروتين الأولي ، والقياس الكيميائي المتوقع ، ومقدار الحضانة اللازمة للسماح للتفاعل بالوصول إلى التوازن.
عندما تم تخفيف خليط IgG-FcRn يدويا ، كان من الصعب اكتشاف وجود معقدات IgG-FcRn ، على الرغم من أنه من المعروف أن هذه البروتينات تتفاعل5. يوضح هذا البحث أن نهج التخفيف السريع يؤدي إلى زيادة ملحوظة في كمية هذه المعقدات. بالنسبة لنفس العينة ، عند استخدام التخفيف السريع ، تمت ملاحظة معقدات 1: 1 FcRn-IgG ومجمعات 2: 1 FcRn-IgG بوضوح. توضح هذه الاختلافات في التكوين المعقد أهمية دراسة أنظمة التفاعل الجزيئي الحيوي عبر مجموعة واسعة من التركيزات.
بالإضافة إلى ذلك ، توضح هذه النتائج أيضا أنه من السهل استخدام الموائع الدقيقة مع تحليل جزيء واحد لالتقاط التفاعلات الضعيفة – لسد فجوة كبيرة في الطريقة. يوفر الجمع بين الموائع الدقيقة للتخفيف السريع والقياس الضوئي الشامل مزايا جذابة بسبب مزايا القياس الضوئي الشامل كتقنية تحليلية. أي أن القياس الضوئي الشامل لا يتطلب ملصقات ، ويتضمن الحد الأدنى من تحضير العينة ، ويتم إجراء القياسات في المحلول. بالنسبة لهذا البروتوكول ، هناك ميزة رئيسية أخرى للقياس الضوئي الشامل وهي قدرته على تمييز وقياس جميع الأنواع المتكونة (بشرط أن يكون لها كتلة مميزة تبلغ >30 كيلو دالتون). هذا على عكس SPR ، على سبيل المثال ، الذي يمكنه قياس معدلات الارتباط وغير الربط ولكن لا يمكنه بسهولة توفير معلومات القياس الكيميائي8.
بالنسبة لهذا البروتوكول ، بالإضافة إلى تجارب القياس الضوئي الشامل بشكل عام ، هناك العديد من الاعتبارات المفيدة. أولا ، يجب أن يكون تركيز البروتين النهائي ضمن حدود ما يمكن أن يقيسه القياس الضوئي الشامل (100 pM-100 nM). يجب أن يكون تركيز حضانة البداية أيضا ضمن نطاق نظام الموائع الدقيقة (حتى 90 ميكرومتر) ويفترض أن يكون أعلى من KD الفعلي للتفاعل10. نقطة البداية الموصى بها هي نسبة مزيج تركيز 1: 1 بين الأنواع المتفاعلة عند تركيز ميكرومتر. يمكن بعد ذلك تغيير النسبة إلى 1: 2 ، 1: 5 ، أو ، كما في حالة هذا التفاعل ، 1:10. إذا لم تكن هناك معلومات سابقة حول تفاعلات البروتين ، فسيتعين على المستخدم تحسين التجربة ، بدءا من تركيز عال (موصى به 20 ميكرومتر) لكل شريك لتحديد ما إذا كان تقارب المكونات ضمن نطاق التركيز الذي تدعمه الطريقة المقدمة (أي تتشكل المجمعات). قد يتضمن التحسين أيضا اختيار ظروف عازلة أخرى لتعزيز التفاعلات أو المعايرة بالتحليل الحجمي لأحد مكونات التفاعل لتحديد نسبة الخلط الصحيحة. بمجرد تحديد هذه ، من الممكن تحسين التركيزات والتدفقات للسماح بالظروف المثلى للدراسة والطريقة ، على سبيل المثال ، تقليل التركيزات للسماح بتحليل أفضل للذروة.
ثانيا ، لتكرار هذه التجربة بنجاح ، يجب تقليل الشوائب. تشمل المصادر الشائعة للشوائب المعروفة بتأثيرها السلبي على قياسات القياس الضوئي الشامل البروتينات الأخرى أو الحطام الخلوي الذي يبقى بعد التنقية ، والمخازن المؤقتة غير المفلترة ، والمنظفات المكونة للمذيلة (إذا كانت موجودة بتركيز عال جدا) ، والمخازن المؤقتة التي تحتوي على تركيزات عالية من الملح أو الجلسرين أو مكونات أخرى. كما نوقش في البروتوكول أعلاه ، يجب إزالة الفقاعات في نظام الموائع الدقيقة. يمكن أن تتشكل الفقاعات في نظام الأنابيب أو إذا كانت العينات ذات توتر سطحي مرتفع وعرضة لتشكيل الرغوة. يمكن أن تتشكل الفقاعات أيضا في زيت الغمر ، والتي يمكن اكتشافها من حلقة التركيز (الشكل 3). إذا تعذر إزالة الفقاعات باستخدام الخطوات الموضحة في البروتوكول ، فإن الحل الآخر هو إزالة الغاز من العينة باستخدام مجفف ومضخة تفريغ ، وترك العينة تحت ضغط منخفض لبضع دقائق. لا ينصح باستخدام دوامة أو هز محاليل البروتين عالية التركيز لأن هذه الإجراءات قد تعزز تكوين الفقاعة.
بينما يتم توضيح قياس تفاعل واحد محدد بين البروتين والبروتين هنا ، يمكن تطبيق نفس البروتوكول على أنظمة تفاعل البروتين والبروتين الأخرى دون تعديل كبير. وهناك اتجاه مستقبلي آخر لهذا البروتوكول هو استخدام القياسات لحساب قيم KD للمعقدات المحددة ، كما تم وصفه في مكان آخر في سياق القياس الضوئي للكتلة 5,7. بينما استخدمت الدراسات السابقة بيانات من التجارب التي تنطوي على التخفيف اليدوي والتفاعلات الأقوى ، يمكن تطبيق مبدأ التحليل بسهولة في هذا السياق – بشرط تنفيذ المزيد من التحسينات في جهاز الموائع الدقيقة (مثل زيادة دقة مستشعر التدفق واستقرار المضخة).
بالإضافة إلى تفاعلات البروتين والبروتين ، من المحتمل أن تكون هناك تطبيقات أوسع لنهج قياس الكتلة الضوئية المشترك ونهج الموائع الدقيقة للتخفيف السريع. يمكن استخدام القياس الضوئي الشامل لتقييم نقاء العينة وتجميعها وتجانسها18,19 ؛ دراسة قلة البروتين20 ، تجميع الجزيئاتالكبيرة 21 أو البلمرة22 ؛ وفي مناطق أخرى. يمتد تحليل القياس الضوئي الشامل أيضا إلى ما هو أبعد من البروتينات. تم استخدامه لدراسة التفاعلات بين الأحماض النووية والبروتينات23 والجسيمات الفيروسية24 والجسيمات النانوية25. وهكذا يصف هذا البروتوكول تطبيقا مهما لنظام الموائع الدقيقة للقياس الضوئي الشامل المشترك – فهو يتيح القياس المباشر للتفاعلات الضعيفة بين البروتين والبروتين على مستوى الجزيئات والمجمعات الفردية. قيمة التطبيق الحالي عالية ، لأنه يفتح إمكانية توصيف التفاعلات بشكل مباشر والتي كان من الصعب دراستها بشكل عام – مع أهميتها عبر المجالات العلاجية الحرجة. ويمكن أن يكون هذا النهج المشترك أيضا بمثابة أساس لمجموعة أوسع من التحقيقات للعينات ذات التركيزات التي تصل إلى عشرات الميكرومولات.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم دعم WS من قبل زمالة قادة المستقبل UKRI [MR / V02213X / 1]. تم إعداد نص المخطوطة ورسوماتها بدعم من أعضاء فريق الاتصالات العلمية في ريفين (باناجيوتا باجانوبولو ونيوس توريس تاماريت وكاثرين ليشتن). كما نعترف بالتعليقات القيمة من كاميل هيتيز وصوفيا فيريرا وماتياس لانغهورست.
Materials
| 2-Propanol (Isopropanol) | VWR International LLC | 20880.320 | |
| Data acquisition software | Refeyn | AcquireMP (v2022 R1) | |
| Data analysis software | Refeyn | DiscoverMP (v2022 R1) | |
| FCRN, His-Tag | Sigma | SRP0624 | |
| Herceptin (IgG) | Cambridge Bioscience | HY-P9907-1mg | |
| Mass photometer | Refeyn | TwoMP | |
| Microfluidics box | Refeyn | MassFluidix HC system | |
| Microfluidics chip | Refeyn | MassFluidix HC chip | |
| Microfluidics control software | Fluigent | OxyGEN | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 1x Ultra Pure | VWR International LLC | K812 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma | S2770 | |
| β-Amylase, from sweet potato | Sigma | A8781 |
参考文献
- Arter, W. E., Levin, A., Krainer, G., Knowles, T. P. J. Microfluidic approaches for the analysis of protein-protein interactions in solution. Biophysical Reviews. 12 (2), 575-585 (2020).
- Hellenkamp, B., Thurn, J., Stadlmeier, M., Hugel, T. Kinetics of transient protein complexes determined via diffusion-independent microfluidic mixing and fluorescence stoichiometry. The Journal of Physical Chemistry. B. 122 (49), 11554-11560 (2018).
- Li, Z. Editorial: Methods in structural biology: Cryo-electron microscopy. Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 1041386 (2022).
- Herling, T. W., et al. A microfluidic platform for real-time detection and quantification of protein-ligand interactions. Biophysical Journal. 110 (9), 1957-1966 (2016).
- Soltermann, F., et al. Quantifying protein-protein interactions by molecular counting with mass photometry. Angewandte Chemie International Edition. 59 (27), 10774-10779 (2020).
- Wu, D., Piszczek, G. Rapid determination of antibody-antigen affinity by mass photometry. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 168, 61784 (2021).
- Wu, D., Piszczek, G. Measuring the affinity of protein-protein interactions on a single-molecule level by mass photometry. Analytical Biochemistry. 592, 113575 (2020).
- Young, G., et al. Quantitative mass imaging of single biological macromolecules. Science. 360 (6387), 423-427 (2018).
- Zijlstra, N., et al. Rapid microfluidic dilution for single-molecule spectroscopy of low-affinity biomolecular complexes. Angewandte Chemie International Edition. 56 (25), 7126-7129 (2017).
- MassFluidix® HC system for rapid dilution via microfluidics. Available from: https://www.refeyn.com/massfluidix-hc-system (2023)
- Pollard, T. D. A guide to simple and informative binding assays. Molecular Biology of the Cell. 21 (23), 4061-4067 (2010).
- Jarmoskaite, I., AlSadhan, I., Vaidyanathan, P. P., Herschlag, D. How to measure and evaluate binding affinities. eLife. 9, e57264 (2020).
- Monnet, C., et al. Selection of IgG variants with increased FcRn binding using random and directed mutagenesis: Impact on effector functions. Frontiers in Immunology. 6, 39 (2015).
- . Refeyn TwoMP: Transforming biomolecular characterisation Available from: https://www.refeyn.com/twomp-mass-photometer (2022)
- Lai, S. -. H., Tamara, S., Heck, A. J. R. Single-particle mass analysis of intact ribosomes by mass photometry and Orbitrap-based charge detection mass spectrometry. iScience. 24 (11), 103211 (2021).
- Wu, D., Piszczek, G. Standard protocol for mass photometry experiments. European Biophysics Journal. 50 (3-4), 403-409 (2021).
- Vaughn, D. E., Bjorkman, P. J. Structural basis of pH-dependent antibody binding by the neonatal Fc receptor. Structure. 6 (1), 63-73 (1998).
- Niebling, S., et al. Biophysical screening pipeline for Cryo-EM grid preparation of membrane proteins. Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 882288 (2022).
- Paul, S. S., Lyons, A., Kirchner, R., Woodside, M. T. Quantifying oligomer populations in real time during protein aggregation using single-molecule mass photometry. ACS Nano. 16 (10), 16462-16470 (2022).
- Schulz, L., et al. Evolution of increased complexity and specificity at the dawn of form I Rubiscos. Science. 378 (6616), 155-160 (2022).
- Malay, A. D., et al. An ultra-stable gold-coordinated protein cage displaying reversible assembly. Nature. 569 (7756), 438-442 (2019).
- Hundt, N., Cole, D., Hantke, M. F., Miller, J. J., Struwe, W. B., Kukura, P. Direct observation of the molecular mechanism underlying protein polymerization. Science Advances. 8 (35), eabm7935 (2022).
- Acharya, A., et al. Distinct RPA domains promote recruitment and the helicase-nuclease activities of Dna2. Nature Communications. 12, 6521 (2021).
- Ebberink, E. H. T. M., Ruisinger, A., Nuebel, M., Thomann, M., Heck, A. J. R. Assessing production variability in empty and filled adeno-associated viruses by single molecule mass analyses. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 27, 491-501 (2022).
- Melo, L., et al. Size distributions of gold nanoparticles in solution measured by single-particle mass photometry. The Journal of Physical Chemistry B. 125 (45), 12466-12475 (2021).
