概要

Generación de modelos de lesiones retinianas en renacuajos de Xenopus

Published: October 13, 2023
doi:

概要

Hemos desarrollado varios protocolos para inducir daño retiniano o degeneración retiniana en renacuajos de Xenopus laevis . Estos modelos ofrecen la posibilidad de estudiar los mecanismos de regeneración de la retina.

Abstract

Las enfermedades neurodegenerativas de la retina son las principales causas de ceguera. Entre las numerosas estrategias terapéuticas que se están explorando, la estimulación de la autorreparación ha surgido recientemente como particularmente atractiva. Una fuente celular de interés para la reparación de la retina es la célula glial de Müller, que alberga potencial de células madre y una extraordinaria capacidad regenerativa en los anamniotas. Sin embargo, este potencial es muy limitado en los mamíferos. El estudio de los mecanismos moleculares que subyacen a la regeneración de la retina en modelos animales con capacidades regenerativas debería proporcionar información sobre cómo desbloquear la capacidad latente de las células de Müller de mamíferos para regenerar la retina. Este es un paso clave para el desarrollo de estrategias terapéuticas en medicina regenerativa. Con este objetivo, desarrollamos varios paradigmas de lesión retiniana en Xenopus: una lesión retiniana mecánica, una línea transgénica que permite la ablación condicional de fotorreceptores mediada por nitroreductasa, un modelo de retinosis pigmentaria basado en la eliminación de rodopsina mediada por CRISPR/Cas9 y un modelo citotóxico impulsado por inyecciones intraoculares de CoCl2 . Destacando sus ventajas y desventajas, describimos aquí esta serie de protocolos que generan diversas condiciones degenerativas y permiten el estudio de la regeneración retiniana en Xenopus.

Introduction

Millones de personas en todo el mundo padecen diversas enfermedades degenerativas de la retina que conducen a la ceguera, como la retinosis pigmentaria, la retinopatía diabética o la degeneración macular asociada a la edad (DMAE). Hasta la fecha, estas afecciones siguen siendo en gran medida intratables. Los enfoques terapéuticos actuales que se están evaluando incluyen la terapia génica, los trasplantes de células o tejidos, los tratamientos neuroprotectores, la optogenética y los dispositivos protésicos. Otra estrategia emergente se basa en la autorregeneración a través de la activación de células endógenas con potencial de células madre. Las células gliales de Müller, el principal tipo de célula glial de la retina, se encuentran entre las fuentes celulares de interés en este contexto. Al lesionarse, pueden desdiferenciarse, proliferar y generar neuronas 1,2,3. Aunque este proceso es muy efectivo en el pez cebra o Xenopus, es en gran medida ineficiente en los mamíferos.

Sin embargo, se ha demostrado que los tratamientos apropiados con proteínas mitogénicas o la sobreexpresión de diversos factores pueden inducir la reentrada en el ciclo celular de la glía de Müller en mamíferos y, en algunos casos, desencadenar su posterior compromiso neurogénico 1,2,3,4,5. Sin embargo, esto sigue siendo en gran medida insuficiente para los tratamientos. Por lo tanto, es necesario aumentar nuestro conocimiento de los mecanismos moleculares que subyacen a la regeneración para identificar moléculas capaces de convertir de manera eficiente las propiedades de las células madre de Müller en nuevas estrategias terapéuticas celulares.

Con este objetivo, desarrollamos varios paradigmas de lesión en Xenopus que desencadenan la degeneración de las células de la retina. Aquí, presentamos (1) una lesión mecánica de la retina que no es específica del tipo de célula, (2) un modelo de ablación celular condicional y reversible utilizando el sistema NTR-MTZ que se dirige a los bastones, (3) un knockout de rodopsina mediado por CRISPR/Cas9, un modelo de retinosis pigmentaria que desencadena la degeneración progresiva de los bastones, y (4) un CoCl2-modelo citotóxico inducido que, según la dosis, puede dirigirse específicamente a los conos o provocar una degeneración más amplia de las células de la retina. Destacamos las particularidades, ventajas y desventajas de cada paradigma.

Protocol

El cuidado y la experimentación de los animales se llevaron a cabo de acuerdo con los lineamientos institucionales, bajo la licencia institucional A91272108. Los protocolos de estudio fueron aprobados por el comité institucional de cuidado animal CEEA #59 y recibieron la autorización de la Dirección Departamental de la Protección de las Poblaciones bajo el número de referencia APAFIS #32589-2021072719047904 v4 y APAFIS #21474-2019071210549691 v2. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalle…

Representative Results

Lesión mecánica de la retinaLas secciones retinianas de renacuajos sometidos a la lesión mecánica descrita en la sección 1 del protocolo muestran que la lesión retiniana abarca todas las capas del tejido y se limita al lugar de punción (Figura 2A, B). Ablación condicional de bastones mediante el sistema NTR-MTZLos ojos de renacuajos transgénicos Tg(rho:GFP-NTR) anestesiados tratados con t…

Discussion

Ventajas y desventajas de varios paradigmas de lesión retiniana en renacuajos de Xenopus

Lesión mecánica de la retina
Se han desarrollado varias lesiones quirúrgicas de la retina neural en renacuajos de Xenopus. La retina neural puede ser extirpada por completo15,16 o sólo parcialmenteextirpada 16,17. La lesión mecán…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Esta investigación contó con el apoyo de becas a M.P. de la Association Retina France, la Fondation de France, FMR (Fondation Maladies Rares), BBS (Association du syndrome de Bardet-Biedl) y UNADEV (Union Nationale des Aveugles et Déficients Visuels) en colaboración con ITMO NNP (Institut Thématique Multi-Organisme Neurosciences, sciences cognitives, neurologie, psychiatrie) / AVIESAN (Alliance Nationale pour les sciences de la vie et de la santé).

Materials

1,2-Propanediol (propylène glycol) Sigma-Aldrich 398039
Absolute ethanol ≥99.8% VWR chemicals 20821-365
Anti-Cleaved Caspase 3 antibody (rabbit) Cell signaling 9661S Dilution 1/300
Anti-GFP antibody (chicken) Aveslabs GFP-1020 Dilution 1/500
Anti-M-Opsin antibody (rabbit) Sigma-Aldrich AB5405 Dilution 1/500
Anti-mouse secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat) Invitrogen Thermo Scientific A11005 Dilution 1/1,000
Anti-Otx2 antibody (rabbit) Abcam Ab183951 Dilution 1/100
Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (goat) Invitrogen Thermo Scientific A11008 Dilution 1/1,000
Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 594 (goat) Invitrogen Thermo Scientific A11012 Dilution 1/1,000
Anti-Recoverin antibody (rabbit) Sigma-Aldrich AB5585 Dilution 1/500
Anti-Rhodopsin antibody (mouse) Sigma-Aldrich MABN15 Dilution 1/1,000
Anti-S-Opsin antibody (rabbit) Sigma-Aldrich AB5407 Dilution 1/500
Apoptotis detection kit (Dead end fluorimetric TUNEL system) Promega G3250
Benzocaine  Sigma-Aldrich E1501 Stock solution 10%
bisBenzimide H 33258 (Hoechst) Sigma-Aldrich B2883 Stock solution 10 mg/mL
Butanol-1 ≥99.5% VWR chemicals 20810.298
Calcium chloride dihydrate (CaCl2, 2H2O) Sigma-Aldrich (Supelco) 1.02382 Use at 0.1 M
Cas9 (EnGen Spy Cas9 NLS) New England Biolabs M0646T
Clark Capillary Glass model GC100TF-10 Warner Instruments (Harvard Apparatus) 30-0038
Cobalt(II) chloride hexahydrate (CoCl2, 6H2O) Sigma-Aldrich C8661 Stock solution 100 mM
Coverslip 24 x 60 mm VWR 631-1575
Dako REAL ab diluent  Agilent S202230-2
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418
Electronic Rotary Microtome Thermo Scientific Microm HM 340E 
Eosin 1% aqueous RAL Diagnostics 312740
Fluorescein lysine dextran   Invitrogen Thermo Scientific D1822
Fluorescent stereomicroscope Olympus SZX 200
Gentamycin Euromedex EU0410-B
Glycerin albumin acc. Mallory Diapath E0012 Use at 3% in water
Hematoxylin (Mayer's Hemalun) RAL Diagnostics 320550
HEPES potassium salt Sigma-Aldrich H0527
Human chorionic gonadotropin hormone MSD Animal Health Chorulon 1500
Hydrochloric acid fuming, 37% (HCl) Sigma-Aldrich (SAFC) 1.00314
L-Cysteine hydrochloride monohydrate Sigma-Aldrich C7880 Use at 2% in 0.1x MBS (pH 7.8 – 8.0)
Magnesium Sulfate Heptahydrate (MgSO4, 7H2O) Sigma-Aldrich (Supelco) 1.05886
Metronidazole  Sigma-Aldrich (Supelco) M3761 Use at 10 mM
Microloader tips Eppendorf 5242956003
Micropipette puller (P-97 Flaming/Brown) Sutter Instrument Co. Model P-97 Program : Heat 700 / Pull 100 / Vel 75 / Time 90 / Unlocked p = 500
Mounting medium to preserve fluorescence, FluorSave Reagent Millipore 345789
Mounting medium, Eukitt Chem-Lab CL04.0503.0500
MX35 Ultra Microtome blade Epredia 3053835
Needle Agani 25 G x 5/8'' Terumo AN*2516R1
Nickel Plated Pin Holder Fine Science Tools 26016-12
Nylon filtration tissue (sifting fabric) NITEX, mesh opening 1,000 µm Sefar 06-1000/44
Paraffin histowax without DMSO Histolab 00403
Paraformaldehyde solution (32%) Electron Microscopy Sciences EM-15714-S Use at 4% in 1x PBS pH 7.4
Peel-A-Way Disposable Embedding Molds Epredia 2219
Pestle VWR 431-0094
Petri Dish 100 mm Corning Gosselin SB93-101
Petri Dish 55 mm Corning Gosselin BP53-06
Phosphate Buffer Saline Solution (PBS) 10x Euromedex ET330-A
PicoSpritzer Microinjection system Parker Instrumentation Products PicoSpritzer III
Pins  Fine Science Tools 26002-20
Polysucrose (Ficoll PM 400 ) Sigma-Aldrich F4375 Use at 3% in 0.1x MBS
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P3911
Powdered fry food : sera Micron Nature sera 45475 (00720)
Scissors dissection Fine Science Tools 14090-09
Slide Superfrost   KNITTEL Glass VS11171076FKA 
Slide warmer Kunz instruments HP-3
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S7653
Sodium citrate trisodium salt dihydrate (C6H5Na3O7, 2H2O) VWR chemicals 27833.294
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich (Supelco) 1.06329
Sodium hydroxide 30% aqueous solution (NaOH) VWR chemicals 28217-292
Stereomicroscope Zeiss Stemi 2000
Syringes Omnifix-F Solo Single-use Syringes 1 mL B-BRAUN 9161406V
trans-activating crRNA (tracrRNA) Integrated DNA Technologies 1072533
Triton X-100 Sigma-Aldrich X-100
Tween-20 Sigma-Aldrich P9416
X-Cite 200DC Fluorescence Illuminator X-Cite  200DC
Xylene ≥98.5%  VWR chemicals 28975-325

参考文献

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記事を引用
Parain, K., Donval, A., Chesneau, A., Lun, J. X., Borday, C., Perron, M. Generating Retinal Injury Models in Xenopus Tadpoles. J. Vis. Exp. (200), e65771, doi:10.3791/65771 (2023).

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