这项工作提出了一种替代的扁平安装视网膜制剂,其中去除感光细胞体可以更快地传播抗体并改善贴片移液器对视网膜内神经元的访问,以进行免疫组织化学、 原位 杂交和电生理学实验。
脊椎动物视网膜的双极细胞和水平细胞是光子被光感受器检测到后第一个处理视觉信息的神经元。它们执行基本操作,例如光适应、对比敏感度以及空间和颜色对立性。全面了解控制其行为的精确电路和生化机制将推动视觉神经科学研究和眼科医学的发展。然而,目前用于检查双极和水平细胞(视网膜整体支架和垂直切片)的制剂在捕获这些细胞的解剖结构和生理学方面的能力有限。在这项工作中,我们提出了一种从活的、扁平的小鼠视网膜中去除感光细胞体的方法,为有效的膜片钳和快速免疫标记提供了增强的双极和水平细胞通道。分裂视网膜的制备方法是将分离的小鼠视网膜夹在两块硝酸纤维素之间,然后轻轻地将它们剥离。分离将外丛状层上方的视网膜分裂,产生两块硝酸纤维素,一块包含感光细胞体,另一块包含剩余的内视网膜。与垂直视网膜切片不同,分裂视网膜制备不会切断视网膜内神经元的树突状过程,从而允许来自双极和水平细胞的记录,这些细胞整合了间隙连接耦合网络和宽场无长突细胞的贡献。这项工作证明了这种制剂在电生理学、免疫组织化学和 原位 杂交实验中研究水平和双极细胞的多功能性。
视网膜是位于后眼的薄神经组织,光线被拦截并处理成可以被大脑解释的电化学信号。在视网膜的后部,视杆细胞和视锥细胞的光感受器受到光的刺激,从而降低了神经递质谷氨酸1的强直释放速率。第一个经历并响应这种光诱导的谷氨酸浓度变化的神经元是双极细胞 (BC) 和水平细胞 (HC),它们的体细胞位于内核层 (INL) 的最外层区域。这些二阶神经元在视网膜中执行信号处理的第一阶段,并塑造视觉的关键特征,例如光适应、对比敏感度和空间/颜色对立度2。虽然这些功能已归因于 BC 和 HC,但这些过程背后的电路和生化机制尚不完全清楚3.因此,探索 BC 和 HC 生理学的工具和方法的进步至关重要。
垂直(横向)视网膜切片长期以来一直被证明是研究 BC 和 HC 的最实用模型;然而,在此模型下,实验者无法访问 BC 和 HC 生理学的某些方面。来自 HC 的直接记录或间接测量它们对 BC 的影响并不能反映视网膜的内源性连接,因为这些细胞的横向过程在切片过程中被切断。整个视网膜制剂通过保留这些侧向突来规避这个问题,但周围的视网膜层对进入这些细胞构成了挑战4。虽然有大量来自全视网膜 INL 神经元的免疫染色5、6、7、8 和膜片钳记录9 的例子,但有机会加快和简化这些数据的收集。因此,横截面的固有局限性和整个支架模型的挑战激发了这种替代平坦支架视网膜制剂的开发。
以下工作描述了一种方案,用于从活的扁平安装视网膜中轻松去除感光层,以增强对 BC 和 HC 的访问,从而简化膜片钳和更快、更有效的免疫标记。剥离附着在孤立视网膜两侧的两片硝酸纤维素膜,通过感光器轴突撕裂组织,留下一个分裂的视网膜,保留外丛状层 (OPL) 和所有内视网膜层。虽然其他人已经描述了机械分离视网膜层的方案,但这些方法要么不适合膜片钳和显微镜应用,要么需要对组织进行繁琐的操作。其中一些方法需要冷冻或冻干组织进行层分离,这使得它们与电生理学实验不相容10,11,12。其他的则设计用于活组织,但需要用滤纸 4,11 连续剥离 5-15 次或用胰蛋白酶 13 处理以去除光感受器。这里描述的技术通过简化感光器去除程序和扩展下游应用库来改进其前身。
在光感受器将光子吸收转化为神经递质释放后,BC 和 HC 是第一个处理视觉信号的视网膜神经元23。虽然这些神经元的重要性得到了很好的理解,但它们的许多功能尚未完全理解或完全未被探索。许多 BC 和 HC 生理学研究可能会受益于扁平安装视网膜制剂,该制剂可改善对 INL 神经元的访问,同时保持横向连接。分裂视网膜方法的开发代表了一种努力,旨在提供一种简单的协议,用于以平面安装方向从 BC 和 HC 获取高质量的电生理记录和显微镜数据。这里描述的分裂视网膜制备可以在视网膜分离后每只小鼠约20分钟(每个视网膜10分钟)内进行,而无需使用专门的设备。该方法从现有的感光器去除程序中汲取灵感,但在简单性、速度和多功能性方面提供了显着改进 4,10,11,12,13。与以前分离视网膜层的方法不同,视网膜分裂不需要冷冻、冻干或在视网膜上重复涂抹粘合剂。通过实践,几乎所有的光感受器都可以用硝酸纤维素膜在一次撕裂中去除。这种方法的速度和易用性使人们能够最大限度地减少视网膜从碳化艾姆斯中花费的时间,从而实现长时间的高细胞活力;分裂的视网膜可以在分裂后在碳化的 Ames 培养基中维持数小时。作为该制剂中INL神经元健康的证明,活/死细胞染色(图4)和膜片钳电生理学(图6)证实了分裂后红细胞和HC的活力。
在免疫标记过程中,分离视网膜中感光层的去除通过显着减少抗体进入 INL 的扩散时间,在免疫标记过程中具有显着优势。一抗和二抗标记可在 2 小时内完成,这比传统的平贴染色有了实质性改进,传统的平贴染色可能需要 72 小时或更长时间,具体取决于靶标5、6、7、8、20、22。因此,显微镜数据可以在组织制备的同一天获得,大大加快了免疫荧光实验的步伐。为了促进 mRNA 探针退火,FISH 实验通常推荐比免疫标记18 更长的固定时间(~24 小时)。然而,这里介绍的实验表明,2 小时固定仍然会产生出色的 FISH 标记(图 5)。尽管将固定时间从 30 分钟延长到 2 小时,但无需执行抗原修复步骤即可获得出色的免疫标记,但这可能因抗体或抗原而异。FISH方案中的蛋白酶处理可能会干扰抗体标记,这可能是由于靶表位的破坏。通过使用靶向多个表位的多克隆抗体来规避这个问题,从而降低了表位破坏阻碍免疫标记的可能性。此外,使用适度的蛋白酶处理(ACD蛋白酶III)来防止过度的表位改变,同时仍提供足够的组织渗透。
有时,视网膜会分裂穿过外核层 (ONL),留下没有可见 INL 细胞的感光体层。为防止这种情况,应确保视网膜完全平放在玻璃上,并且已清除视网膜周围的任何残留液体。用画笔更牢固地按压硝酸纤维素也可能有助于防止通过 ONL 分裂。如果膜变得太湿或视网膜自行折叠,成功分裂的机会将大大降低。使用DAPI对细胞核进行染色有助于评估分裂的质量并确定剩余光感受器的覆盖率。感光细胞核更小、更亮、更浅(补充图3A),而BC细胞核更大、更暗、更深(补充图3B)。在某些情况下,撕裂的平面在视网膜上会略有不同,导致光感受器细胞体未完全去除的斑块(补充图3C)。对于显微镜和电生理学中的应用,这并不妨碍从正确去除光感受器的区域收集高质量数据的能力;使用贴片移液器成像或记录时,可以很容易地发现大面积暴露的内视网膜。如果需要更彻底地去除感光器,可以使用额外的硝酸纤维素膜进行第二次撕裂,尽管不能保证 100% 去除感光器。因此,在基因表达或蛋白质组学研究中使用分裂视网膜时,建议谨慎使用残留的感光器材料可能会影响结果。对于单细胞应用,这种担忧是没有根据的,因为来自光感受器的数据可以被排除在分析之外。
分裂视网膜制备的优点可能在宽场中间神经元的电生理记录中最为突出。传统的垂直切片切断了宽视场细胞的广泛过程,而分裂的视网膜制备使 OPL 和 IPL 完好无损,允许人们从宽视场细胞(如 HCs 24、A17s25、TH ACs 26 和 NOS-1 ACs27)捕获输入,否则这些输入在垂直切片中会被忽略。因此,对结果的解释以及与先前从视网膜切片收集的数据进行比较需要仔细考虑。尽管如此,在使用光刺激的药理学模拟物的实验中,这些结果类似于从视网膜切片记录的数据19。通过在细胞特异性启动子下表达 ChR2,可以在 INL 中记录 BC 的同时刺激所需的细胞群,以研究所需细胞对垂直信息通路的影响。在分裂的视网膜中,直接从更深的INL神经元(如无长突细胞)进行记录也是可行的。虽然在这种情况下,贴片电极必须首先穿过更浅表的INL神经元,但与传统的全贴片制备相比,阻碍其路径的组织要少得多。
除了测量宽场细胞对其他神经元的影响外,该方法还能够从 HC 直接进行单细胞膜片钳,HC 的树突在 OPL28 中形成广泛的间隙连接耦合网络。水平细胞向光感受器发送关键反馈,从而塑造垂直信息通过视网膜的传输。然而,由于HC的树突状场在垂直切片中被截断,因此缺乏单细胞记录数据。这项工作提出了解剖学和生理学上完整的HC,从中记录ChR2诱发电流的三转基因小鼠系(图6 CE)。在 ChR2 刺激之外,分裂视网膜可用于研究内源性 HC 电流和间隙连接耦合28。虽然分裂视网膜为研究化学应用或 ChR2 刺激诱导的突触连接和神经元活动提供了一个方便的模型,但缺乏光感受器排除了对自然光反应或光适应机制的任何直接探索。
近年来,视网膜原位成像取得了令人钦佩的进展。然而,大多数影像学研究仅限于整个视网膜制剂中的神经节细胞层29。作者设想,分裂视网膜中没有光感受器将使其成为OPL和INL中实时钙成像的理想模型。除了钙成像之外,该模型还具有与基因编码生物传感器(如 iGluSnFR30,31、iGABASnFR 32 和 pHluorin 33)一起使用的巨大潜力。结合分裂视网膜准备,这些强大的工具可能为探索有助于视网膜光处理的 BC 和 HC 的突触相互作用和生物物理特性提供有效的方法。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了以下 NIH 资助的支持:NIH 资助R01EY031596(给 CM);美国国立卫生研究院拨款R01EY029985(给 CM);美国国立卫生研究院(NIH)拨款P30EY010572(C.M.);NIH 拨款R01EY032564(至 BS)。我们感谢 Tammie Haley 在准备视网膜切片方面的技术支持,以及 Charles Allen 博士慷慨地贡献了这项工作中使用的 mRNA FISH 探针。
#1.5 glass coverslips | Fisherbrand | 12544E | |
2 pairs of Dumont #5 forceps | Ted Pella | 38125 | |
25 gauge needle | Becton Dickenson | 305122 | |
470 nm LED | THORLABS | M470L2 | |
5-306 curved scissors | Miltex | 5-306 | |
9" disposable pasteur pipetes | Fisherbrand | 13-678-20D | for constructing custom transfer pipette |
Ai80d mouse | Jackson Laboratories | 25109 | RRID: IMSR_JAX:025109 |
Ames Medium w/L-Glutamate | US Biological | A1372-25 | |
amplifier control software | Molecular Devices | Clampex 10.3 software | |
anti-calbindin D28K antibody | Invitrogen | PA-5 85669 | RRID: AB_2792808, host species = rabbit; 1:100 dilution |
anti-CtBP2 antibody | BD Biosciences | 612044 | RRID: AB_399431, host species = mouse; 1:5000 dilution |
anti-GPR179 antibody | NA | NA | gift from Kirill Martemyanov; Scripps Research Institute, Jupiter, FL; host species = sheep; 1:1000 dilution |
anti-PKC alpha antibody | Sigma-Aldrich | P4334 | RRID: AB_477345, host species = rabbit; 1:5000 dilution |
anti-PKC alpha antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc8393 AF594 | RRID: AB_628142, host species = mouse; 1:1000 dilution |
anti-PSD95 antibody | BD Transduction Laboratories | 610495 | RRID: AB_397862, host species = mouse; 1:1000 dilution |
anti-RGS11 antibody | NA | NA | gift from Ted Wensel; Baylor College of Medicine, Houston, TX; host species = rabbit; between 1:1000 and 1:5000 dilution |
anti-Synaptophysin P38 antibody | Sigma | S-S5768 | RRID: AB_477523, host species = mouse; 1:1000 dilution |
Aquamount mounting media | Epredia | 13800 | slide mounting media |
C57BL/6J mouse | Jackson Laboratories | 000664 | RRID: IMSR_JAX:000664 |
carbogen tank | Matheson | NA | 95% O2 and 5% CO2 |
custom transfer pipette | custom build | NA | Instructions: use scissors to cut off the tip of a plasitc transfer pipette at the point it begins to taper. Use pliers to safely break off the last 2-3 inches of a glass pasteur pipette. Fit the narrow end of the glass pasteur pipette into the wide tip of the plastic transfer pipete. Wrap parafilm around the joint of the two pieces to enhance the seal. |
Digitical optical power meter | THORLABS | PM100D | |
dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
electrophysiology amplifier | Molecular Devices | Axopatch 200B | |
electrophysiology microscope | Olympus | OLYMPUS, BX50WI | Dodt gradient contrast microscopy |
Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
HC PL APO CS2 40x/1.3 | Leica | 506358 | |
HC PL APO CS2 63x/1.40 | Leica | 15506350 | |
Hybridization oven | Robbins Scientific | Model 1000 | for RNAscope protocol only |
Immedge hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
isoflurane | Piramal Critical Care | 66794-017-25 | |
Kimwipe (delicate task wipe) | Kimtech Science | 34155 | |
Leica HC PL APO CS2 40x/1.3 oil immersion objective | Leica | 506358 | |
Leica HC PL APO CS2 63x/1.40 oil immersion objective | Leica | 15506350 | |
Leica TCS SP8 X confocal microscope | Leica | discontinued | |
medium 15 mm petri dish | Corning | 25060-60 | eyes are kept here during retina dissection |
Merit 97-275 steel scissors | Merit | 97-275 | |
Micropipette Puller | Sutter Instrument | p-97 | |
Mm-Gabrd-C2 mRNA probe | ACD | 459481-C2 | |
mouse euthanasia chamber | NA | NA | custom build; glass petri dish covering a small glass jar. |
nitrocellulose membrane filters | GE Healthcare Life Sciences; Whatman | 7184-005 | 0.45 µm pore size |
Picospritzer | General Valve Corporation | Picospritzer II | referred to in the text as microcellular injection unit |
plastic transfer pipets | Fisherbrand | 13-711-7M | for constructing custom transfer pipette |
Plastic tubing | Tygon | R-603 | for connection to carbogen tank |
platinum harp | custom build | NA | for anchoring split retinas within the electrophysiology recording chamber. |
size 0 paint brush | generic | NA | for flattening retina during splitting. |
SlowFade Gold antifade reagent | Molecular Probes | S36937 | referred to in the text as anti-fade mounting media |
small 10 mm petri dish | Falcon | 353001 | eyes are placed here following enucleation |
small glass pane (7.5 cm x 5 cm) | generic | NA | isolatd retina pieces are placed onto this for the splitting procedure |
Superfrost plus microscope slides | Fisherbrand | 12-550-15 | electrostatically-charged glass microscope slides |
Thick-walled borosilicate glass pipettes with filament | Sutter Instrument | BF150-86-10HP | |
Vannas Scissors; straight | Titan Medical | TMS121 | not brand specific; any comparable scissors will work |
vGATFLPo mouse | Jackson Laboratories | 29591 | RRID: IMSR_JAX:029591 |
vGlut2Cre mouse | Jackson Laboratories | 28863, 016963 | RRID: IMSR_JAX:028863, RRID: IMSR_JAX:016963 |
Zombie NIR Fixable Viability Kit | BioLegend | 423105 | referred to in the text as MI-NIR |