Retina protezleri görsel algı oluşturma özelliğine sahiptir. Yeni protezlerin geliştirilmesini ilerletmek için, implantasyondan önce cihazları test etmek için ex vivo yöntemlere ihtiyaç vardır. Bu makale, elektriksel stimülasyona maruz kaldığında retinal ganglion hücre tabakasındaki kalsiyum aktivitesini incelemek için kapsamlı bir protokol sunmaktadır.
Retina distrofileri dünya çapında körlüğün önde gelen nedenlerinden biridir. Dejenere retinadaki bozulmuş ışığa duyarlı fotoreseptör hücrelerini atlayabilen, görsel algıları indükleyerek görmeyi kısmen geri kazanmayı amaçlayan gelişmiş retina protezleri geliştirmek için kapsamlı çabalar devam etmektedir. Yaygın bir araştırma yolu, çok sayıda elektrot barındıran, esnek bir fiziksel yapıya sahip implante edilebilir cihazların tasarımını ve üretimini içerir. Bu, görsel algıların verimli ve hassas bir şekilde oluşturulmasını sağlar. Bununla birlikte, her teknolojik ilerlemeyle birlikte, cihazın performansının ötesindeki faktörlerin devreye girdiği in vivo deneylere geçmeden önce cihazın işlevselliğini doğrulamak için güvenilir ve yönetilebilir bir ex vivo yönteme ihtiyaç duyulmaktadır. Bu makale, elektriksel stimülasyonu takiben retinal ganglion hücre tabakasında (GCL) kalsiyum aktivitesini incelemek için kapsamlı bir protokol sunmaktadır. Spesifik olarak, aşağıdaki adımlar özetlenmiştir: (1) genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri kullanılarak sıçan retinasının floresan olarak etiketlenmesi, (2) farklı elektriksel stimülasyon desenleri uygulanırken ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu kullanılarak floresan sinyalinin yakalanması ve (3) GCL içindeki tek tek hücrelerden kalsiyum izlerinin çıkarılması ve analiz edilmesi. Bu prosedürü izleyerek, araştırmacılar in vivo deneyler yapmadan önce yeni stimülasyon protokollerini verimli bir şekilde test edebilirler.
Retina, ışığı algılamaktan sorumlu hücreler olan fotoreseptörleri içerir. Fotonları yakalar ve onları sinir uyarılarına dönüştürürler. Bu uyarılar daha sonra retina içinde işlenir ve görsel kortekse iletilir, bu da görsel bir görüntününoluşumuna neden olur 1. Retinitis Pigmentosa (RP) ve Yaşa Bağlı Makula Dejenerasyonu (YBMD), fotoreseptörlerin ilerleyici kaybı ile karakterize dejeneratif hastalıklardır. Bu retinopatiler, dünya çapında körlüğün önde gelen nedenleriarasındadır1, milyonlarca kişiyi etkiler ve hastalar, sağlık sistemleri ve bir bütün olarak toplum için önemli tıbbi, kişisel ve sosyoekonomik sonuçlara sahiptir. Ayrıca, yaşlanan nüfusla birlikte YBMD vakalarının 2050 yılına kadar %15 oranında artacağı tahmin edilmektedir2.
Şu anda, bu koşullardan etkilenen hastalarda görmeyi geri kazanmak için çok sayıda araştırma çabası devam etmektedir3. Umut verici bir yaklaşım, görmeyi kısmen geri kazanmada etkinliği olan retina protezlerinin kullanılmasıdır 4,5. Bu cihazlar görsel sahneden ışığı yakalar ve elektrik darbelerine dönüştürür. Bu darbeler, göze implante edilmiş bir mikroelektrot dizisi (MEA) içindeki elektrotlar aracılığıyla iletilir, hayatta kalan nöronları uyarır ve kayıp fotoreseptörlerin işlevini atlar. Aktive edilmiş retinal ganglion hücreleri (RGC’ler) çıktıyı beyne iletir ve burada görsel algı olarak yorumlanır. Bununla birlikte, mevcut implantların ana sınırlamaları, elektrot-doku arayüzünün6 çözünürlüğünde ve farklı hücre tiplerinin seçici olmayan stimülasyonunda yatmaktadır. Bu nedenle, daha verimli görme restorasyonu için yeni implante edilebilir cihazların tasarımını optimize etmek için, elektrotlara yakın hücreleri seçici olarak aktive etmek için stimülasyon paradigmalarının nasıl geliştirilebileceğini anlamak çok önemlidir.
Kalsiyum görüntüleme, nöral aktiviteyi incelemek için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir ve optik olmayan yöntemlere göre çeşitli avantajlar sunar 7,8. İlk olarak, hücresel ve hücre altı çözünürlük sağlar. İkincisi, kalsiyum belirteçleri belirli hücre tiplerini hedefleyebilir. Üçüncüsü, uzun süreli izlemeye izin verir ve dördüncüsü, aktif ve aktif olmayan hücreleri ayırt ederken tüm hücre popülasyonlarının gözlemlenmesini sağlar. Bu yöntem, yüzlerce milisaniye aralığında zamansal bir çözünürlükle hücresel aktivitenin dolaylı kanıtını sağlar. GCaMP sensörleri gibi genetik olarak kodlanmış floresan kalsiyum göstergeleri, kalsiyuma bağlandıktan sonra konformasyonel bir değişikliğe uğrar ve bu da floresansın artmasına neden olur9. Rekombinant adeno ilişkili viral vektörler (AAV’ler), GCaMP10 ile retina hücrelerini dönüştürmenin etkili bir yoludur.
Bu protokol, retina implantlarının stimülasyon protokollerini test etmek için kalsiyum görüntülemeyi kullanan etkili bir yöntem sunar. Özellikle, ex vivo sıçan retina dokusuna odaklanıyoruz ve numune alımından veri analizine kadar ayrıntılı adım adım talimatlar sağlıyoruz. Bu kapsamlı kılavuzu sunarak, çeşitli geçmişlere sahip araştırmacılar elektriksel stimülasyon deneylerine güvenle başlayabilirler.
Burada tarif edilen protokol, bir MEA ile sağlanan elektriksel stimülasyon üzerine sıçan retinal GCL’de meydana gelen kalsiyum dinamiklerini incelemeye hizmet eder. Güvenilir ve yönetilebilir bir yöntemdir, ancak özellikle GCL’yi verimli bir şekilde düzgün bir şekilde etiketlemek ve optimal doku-elektrot temasını sağlamak için retinayı düzgün bir şekilde monte etmek için biraz eğitim gerektirir. Bu protokol kemirgenlere özgüdür ve farklı bir laboratuvar türüne uygulandığında uyarlanması gerekir. Metodolojinin kritik noktaları, değişiklikleri ve sınırlamaları ayrıntılı olarak sunulmaktadır.
İntravitreal enjeksiyonlar
Enjeksiyonlar, oküler gen iletimi için yaygın olarak kullanılmaktadır ve intravitreal enjeksiyonlar tercih edilen prosedürdür. İlgilenilen molekülleri doğrudan fotoreseptörler ve retina pigment epiteli (RPE) arasına sokan ve retina dekolmanı riski taşıyan subretinal enjeksiyonlara kıyasla daha güvenli ve daha az invaziv oldukları kanıtlanmıştır10. Bununla birlikte, özellikle kemirgen modellerinde bu enjeksiyonlar yapılırken sınırlamalar vardır. Camsı mizah jelatinimsidir ve viral difüzyonu engeller. Dahası, kemirgen gözlerindeki lens büyüktür, bu da iğneyi çizmeden sokmayı önemsiz hale getirir. Hassas şırınga iğneleri hassastır ve sık sık değiştirilmesi gerekir. Tıkanmayı önlemek için her kullanımdan önce ve sonra deiyonize su ile yıkayın ve düzenli olarak değiştirin. Ek olarak, çözelti reflüsünü ve göz içi basıncındaki değişiklikleri önlemek için içeriği yavaşça enjekte edin. Retina boyunca büyük ve homojen floresan elde etmek pratik gerektirebilir.
Retina hücre transdüksiyonu
Viral vektörler, in vivo gen iletimi için mükemmel bir yöntemdir ve AAV’ler, retina hücrelerini dönüştürmek için yaygın olarak kullanılmaktadır10. İnsan körlüğüne neden olan bazı retinopatilerin tedavisi olarak onaylanmıştır24. Bununla birlikte, taşıyıcı kapasiteleri, gerekli düzenleyici unsurlar (örneğin, destekleyici) dahil olmak üzere 5 kb ile sınırlıdır10,25. Her biri farklı tropizme sahip birden fazla serotip mevcuttur. Verilecek genlere ve dönüştürülecek hücrelere göre en uygun AAV’yi seçin26. RGC’leri etiketlemek için AAV227 kullanılması önerilir.
Gen ekspresyonu penceresi
AAV2-CAG-GCaMP5G için optimal viral ekspresyon, enjeksiyondan 2 ila 3 hafta sonradır12,18. Bu zaman diliminin ötesinde, transfekte edilmiş hücrelerden gelen çekirdekler floresan hale gelir, hücreler uyaranlara yanıt vermeyi bırakır ve sonuçtaölür 7,28,29. Bunun nedeni, çekirdeğe translokasyon olan GCaMP göstergesinin aşırı ekspresyonudur. Optimal gen ekspresyonu için zaman penceresi, viral vektöre ve seçilen promotör30’a bağlı olarak değişecektir ve bu protokole devam etmeden önce deneysel olarak belirlenmesi gerekir.
Doku-elektrot teması
Optimal ve tekrarlanabilir sonuçlar için, iyi bir doku-elektrot teması elde etmek çok önemlidir. Zayıf temas tipik olarak retinanın doğal eğriliğinden kaynaklanır. Bir yaklaşım, retinayı dörde bölmek, her seferinde bir bölüm monte etmek ve görüntülemektir. Retinanın küçük kısımları daha iyi düzleştirilebilir, bu da MEA’nın yüzeyi ile daha etkili temas sağlar. Zayıf temasın bir başka potansiyel nedeni de vitreus mizahının varlığıdır. Bir epi-retinal implantı simüle eden stimülasyon deneyleri yaparken, retina eksizyonu sırasında vitreus mizahının dikkatlice çıkarılması önemlidir, çünkü akıma karşı bir yalıtkan görevi görebilir. Burada, elektrot ve hücreleri aynı odak düzleminde görselleştirerek temasın yeterli olup olmadığını kontrol etmek için basit bir yöntem anlatılmaktadır.
Ex vivo retinal ölçümlere bir alternatif, nöronları doğrudan elektrotların yüzeyinde büyütmektir. Hipokampal nöronlar31 gibi nöronların birincil kültürü, yeni uyarıcı cihazın işlevselliğini değerlendirmek için ilk testler için yararlı olabilir. Bununla birlikte, bu yaklaşım hala laboratuvar hayvanlarının kullanılmasını gerektirir ve stimülasyona sinaptik yanıtları değerlendirmek için önemli olan retina ağının karmaşıklığını temsil etmez.
Elektrotun altındaki hücreleri ve elektrot izlerini görselleştirmek için, indiyum kalay oksit (ITO) gibi şeffaf malzemelerle üretilen MEA’lar kullanılabilir 19,20,32. Optik ölçümlere ek olarak, elektriksel stimülasyon üzerine GCL aktivitesi elektriksel kayıtlar yoluyla değerlendirilebilir. MEA, dokunun lokal alan potansiyelini (LFP) kaydetmek için kullanılabilir. Bununla birlikte, her elektrot aynı anda birden fazla hücreden aktivite yakaladığından (elektrot boyutlarına bağlı olarak) bu, uzamsal çözünürlüğü tehlikeye atar. Optik kayıt bu sınırlamanın üstesinden gelir ve daha yüksek uzamsal çözünürlüklü haritalama sunar. Başlıca avantajı, tek hücreli çözünürlüğe sahip büyük bir FOV’u ölçerken aktif ve aktif olmayan hücreleri ayırt etme yeteneğidir. Tüm hücresel aktivite raportörleri arasında, kalsiyum göstergeleri iyi tanımlanmıştır ve en yaygın olarak kullanılmaktadır33.
The authors have nothing to disclose.
Teknik destekleri için Merche Rivas, Angel Sandoval, Jesús Planagumà, Jordi Cortés, Sandra Ortonobés Lara ve Alina Hirschmann’a (ICFO-Institut de Ciències Fotòniques), intravitreal enjeksiyonlar ve in vivo retinal görüntüleme konusundaki destekleri için Oftalmoloji Araştırma grubundan Anna Duarri’ye (VHIR, Vall d’Hebron Araştırma Enstitüsü) teşekkür ederiz.
Bu çalışmayı destekleyen finansman kuruluşları şunlardır: Fundació CELLEX; Fundació Mir-Puig; Ministerio de Economía y Competitividad – Ar-Ge’de Mükemmeliyet Merkezleri için Severo Ochoa programı (CEX2019-000910-S, [MCIN/AEI/10.13039/501100011033]); CERCA programı aracılığıyla Generalitat de Catalunya; Laserlab-Europe (EU-H2020 GA no. 871124); La Caixa Vakfı (LCF/HR19/52160003); ve Fondo Social Europeo (PRE2020-095721, M.C.).
20x NA 0.75 S Fluor air objective | Nikon | CFI Super Fluor 20X | – |
3.5 cm Cell culture dish | Nunc | 12-565-90 | – |
30 G needle | VWR | 613-5373 | – |
36 G blunt needle | World Precision Instruments | NF36BL-2 | – |
6 cm Cell culture dish | Nunc | 12-565-94 | – |
AAV2-CAG-GCaMP5G | Vector Biolabs | – | – |
Ames' Medium | Sigma Aldrich | A1420 | – |
Blade | Swann-morton | 0308 | – |
Camera | Hamamatsu | ORCA Flash v4.0 | – |
Carbogen | Air liquide | – | – |
Curved-forceps | – | – | – |
Fine spring-scissors | FST | 91501-09 | – |
FITC filter cube | Nikon | Standard series | – |
Fluorescent lamp | Nikon | C-HGFI | – |
Fluorescent stereomicroscope | Nikon | SMZ25 | – |
HBSS | Capricorn | HBSS-1A | – |
ImageJ/FIJI | NIH | v1.50i | – |
In vivo retinal imaging system | Phoenix Research Laboratories | Micron III | – |
Inverted fluorescence microscope | Nikon | Eclipse Ti | – |
Isofluorane | Arrane Baxter Laboratories | – | – |
Long-Evans rat | Janvier | – | – |
MATLAB (Version R2021b) | Mathworks | – | – |
Media filters | Merckmillipore | SCGPS02RE | – |
Methocel 2% | Omni Vision | – | – |
Microelectrode array (MEA) | – | Custom-made | |
NaHCO3 | Thermofisher | 42427 | – |
Penicillin/Streptomycin 100x | Thermofisher | 15140122 | – |
Phenylephrine | Alcon Cusí Laboratories | 653437.3 | 100 mg/mL |
Plastic pipette | VWR | 612-1793 | – |
Porous membrane | Merckmillipore | #JVWP01300 | – |
Precision syringe | World Precision Instruments | 10 µl Nanofil | – |
Prescaina | Llorens | – | Oxybuprocaine chlorhydrate (2 mg/mL), local anesthetic |
Rat nasal mask | Xenotec | XRK-RA | – |
Small curved-forceps | Bbraun | AESCBD311R | – |
Spring-scissors | FST | 15040-11 | – |
Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000 | – |
Straight forceps | FST | 11252-20 | – |
Suture filament | Vitrex Medical | 4328 | Nilon monofilament, 7/0, DS12 |
Tobradex | Alcon Cusí Laboratories | – | Tobramycin (3 mg/mL) and dexamethasone (1 mg/mL) |
Tropicamide | Alcon Cusí Laboratories | 653486 | 10 mg/mL |
Washer | Thorlabs | W8S038 | – |