Подготовка образцов для криотомографии клеток млекопитающих in situ

1. Подготовка сетки ПРИМЕЧАНИЕ: В экспериментальном проекте запланируйте максимум 8-12 решеток на сеанс погружного замораживания и 4-5 решеток на скважину. Более того, это приведет к очень длительному сеансу замораживания, что может вызвать повышенный стресс клеток, загрязнение льдом и ошибки пользователя. Тлеющий разрядЗагрузите соответствующее количество решеток перфорированной углеродной поддерживающей пленкой, которая будет разряжаться при давлении 15 мА в течение 45 с при атмосфере 0,39 мбар в устройстве тлеющего разряда. Убедитесь, что карбоновая сторона решетки обращена вверх. Когда закончите, переложите решетки в чистый контейнер, выстланный фильтровальной бумагой (Рисунок 1A 1).ПРИМЕЧАНИЕ: Другие сетки могут использоваться при условии, что материал не токсичен для клеток (что исключает любую медную сетку). Сетки поиска полезны для корреляционных исследований. Также возможны решетки из других материалов. Многие лаборатории показали хорошие результаты при выращивании клеток на основе опорных решетокSiO2 8,9. Адгезивное лечениеПеренесите сетки, фибронектин, PBS, пластины и пинцет в шкаф биобезопасности. Обработайте обе стороны решетки 20 мкг/мл бычьим фибронектином путем микропипетирования двух больших точек адгезивного раствора на стерильной поверхности, например, на крышке 6-луночного планшета. Убедитесь, что точки достаточно велики, чтобы охватить всю сетку (рекомендуется около 100 мкл).ПРИМЕЧАНИЕ: Перед обработкой выбранным адгезивным раствором существует возможность фотомикроструктурирования сетки для оптимизации прикрепления клеток к центру квадратов сетки. Уменьшение способности ячеек прикрепляться к стержням приведет к увеличению количества визуализируемых ячеек. Это идеально подходит для экспериментов, связанных с измельчением cryoFIB. Используйте пинцет 5/15 для манипуляций с сетками. Обязательно обработайте обе стороны сетки в растворе.ПРИМЕЧАНИЕ: Могут быть использованы другие адгезивные растворы (фибриноген, коллаген, другие компоненты внеклеточного матрикса и т.д.). Здесь используется фибронектин, так как он дает хорошие результаты с самыми разнообразными клеточными линиями. (U2OS, HeLa, Vero, Calu-3, Tzm-bl). Пинцет 5/15 полезен, так как его геометрия обеспечивает улучшенную маневренность вокруг 6-луночных планшетов, 35-миллиметровых тарелок и микропредметных стекол. Это приводит к снижению механической нагрузки на решетки и более неповрежденной углеродной пленке. Перед началом работы убедитесь, что все необходимые материалы помещены в шкаф биобезопасности, так как это снижает вероятность загрязнения сети. Крепление сетокПосле обработки бычьим фибронектином сетка станет липкой. Пинцетом 5/15 осторожно прикоснитесь неуглеродистой поверхностью решетки ко дну пустой тарелки/тарелки и откройте пинцет. Сетка должна легко крепиться к новой поверхности (рис. 1А, 2).ПРИМЕЧАНИЕ: Старайтесь не размещать решетки прямо по центру или по краям тарелки. При добавлении ячеек наблюдается тенденция к накоплению плотности клеток в центре пластины. Это может привести к появлению сеток с чрезмерной плотностью ячеек. В качестве альтернативы здесь можно использовать напечатанные на 3D-принтере держатели сетки вместо того, чтобы прикреплять ячейки непосредственно к поверхности тарелки/тарелки12. ИнкубацияИнкубируют сетки в течение 30 мин в адгезивном растворе фибронектина (20 мкг/мл). Чтобы гарантировать, что решетки не станут сухими во время этого процесса, микропипетки по 1-2 капли более адгезивного раствора непосредственно поверх решеток каждые 15 мин (рис. 1А3).ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубационный период будет варьироваться в зависимости от используемого адгезивного раствора. Для бычьего фибронектина рекомендуемое время составляет 30 мин. СтиркаПосле инкубационного периода удалите излишки адгезивного раствора с помощью микропипетирования. Вымойте решетки, микропипетируя капли PBS непосредственно поверх решеток. Повторите это 2-3 раза. (Рисунок 1А4). СтерилизацияИспользуйте ультрафиолетовый свет для стерилизации решеток в шкафу биобезопасности в течение 1 часа. Разместите решетки как можно ближе к источнику УФ-излучения, чтобы обеспечить максимальную стерилизацию (Рисунок 1A5). Чтобы убедиться, что сетки не становятся сухими во время этого процесса, каждые 10 минут наносите микропипетку по 1-2 капли PBS непосредственно поверх сеток.ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 1.4-1.6 можно выполнять одновременно. 2. Посевные решетки Количество ячеек:Отделите и подсчитайте клетки, используя механические или ферментативные методы. Определите оптимальное количество ячеек, которые будут использоваться для посева перед подсчетом. Для U2OS, высеваемого в 6-луночную пластину, используйте от 6 x 104 до 1,6 x 105 ячеек на лунку (Рисунок 1B1).ПРИМЕЧАНИЕ: Количество засеянных ячеек будет варьироваться в зависимости от типа ячейки, площади поверхности лунки, используемой чашки или микропредметного стекла, времени между посевом и погружным замораживанием, а также дизайна эксперимента. Протестируйте диапазон номеров ячеек, чтобы определить условия, которые приведут к 0,25-1 ячейке на квадрат сетки во время погружного замораживания. Важно отметить, что высокая плотность клеток снижает скорость теплопередачи и может повлиять на процесс витрификации. Для борьбы с этим некоторые лаборатории успешно используют клеточные сетчатые фильтры, которые предотвращаютобразование клеточных скоплений. Наконец, этот протокол приводит к случайному прикреплению клеток к углеродному слою. Если необходимо целенаправленное прикрепление, можно использовать фотомикроузоры (см. шаг 1.3)14. Добавление клеток и питательной среды: Добавляйте клетки с помощью микропипетки в лунки, избегая пузырьков (Рисунок 1B2). В 6-луночном планшете рекомендуется общий объем лунки 1,5-2,0 мл.ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется тщательно намочить сетки, прежде чем добавлять весь объем. Это поможет предотвратить отслоение и всплытие сеток в растворе. Осторожно перемещайте пластину из стороны в сторону, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток по лунке. Не вращайте пластину круговыми движениями, так как это приведет к чрезмерной плотности ячеек в центре лунки. Инкубация: Инкубируйте предметные стекла при температуре 37 °C в течение соответствующего времени в соответствии с планом эксперимента, который будет зависеть от последующих применений. В этом примере (трансфекция молекулярных клонов ВИЧ) инкубируют в течение 16-24 ч (рис. 1B3).ПРИМЕЧАНИЕ: Более длительное время инкубации приведет к большему количеству циклов деления клеток. Поэтому соответствующим образом отрегулируйте стартовое количество ячеек для посева. 3. Трансфекция Приготовление смеси для трансфекции:Подготовьте соответствующий катионный липосомный реагент для трансфекции плазмиды в выбранную клеточную линию. В этом примере трансфекции используют 1 мкг общей плазмидной ДНК на лунку (в 6-луночном планшете) для трансфиции в соотношении 1:3 плазмиды HIViΔEnv к плазмиде psPAX2. Для каждой лунки разводят 1 мкг ДНК в 50 мкл безсывороточного DMEM. Гомогенизируйте смесь с помощью многократного микропипетирования или легкого вращения планшета. Для каждой лунки разведите 3 мкл реагента для трансфекции в безсывороточном DMEM, затем снова гомогенизируйте смесь с помощью микропипетирования или мягкого закручивания. Добавьте всю разбавленную смесь реагентов для трансфекции в разбавленную смесь ДНК (шаг 3.1.2) и инкубируйте при комнатной температуре (RT) в течение 15 мин (рис. 1C 1).ПРИМЕЧАНИЕ: Пока эта смесь инкубируется, замените среду в лунках 1,5 мл свежего DMEM. Будьте осторожны, чтобы не сбить решетки со дна колодца. Для нанесения смеси для трансфекции пипеткой 100 мкл смеси из стадии 3.1.3 по каплям в каждую лунку, концентрируя капли по сеткам для обеспечения контакта (рис. 1C2). Смените питательную среду через 16-24 ч после трансфекции (рис. 1С3). 4. Погружная заморозка ПРИМЕЧАНИЕ: Храните клетки при температуре 37 °C до тех пор, пока они не понадобятся для промокания. Кроме того, обязательно обратите внимание на углеродную сторону решеток на протяжении всего процесса. Плотность ячеекПроверьте сетки в инвертированном оптическом микроскопе и отметьте плотность клеток на каждой сетке.ПРИМЕЧАНИЕ: Сетки с менее чем 0,25 ячейками на квадрат сетки (или одна ячейка на каждые 4 квадрата сетки) считаются пустыми. Сетки с 0,25-1 ячейкой на квадрат сетки считаются «нормальными». Сетки с более чем 1 ячейкой на квадрат сетки считаются «полными». Обратите внимание на плотность ячеек на каждой сетке, чтобы можно было установить время промокания позже во время погружного замораживания. Добавьте 2-3 мл PBS в пустую тарелку/блюдо и нагрейте до 37 °C. Подготовка реперных знаковЧтобы подготовить реперные точки золота для последующей криотомографии, пипетку 50 мкл раствора коллоидных золотых шариков 10 нм в чистую пробирку объемом 1,5 мл. Добавьте в пробирку 2 мкл 1 мг/мл БСА и гомогенизируйте путем многократного микропипетирования. Центрифугируйте пробирку при 15 000-20 000 x g в течение 15 мин. Микропипетка для удаления как можно большего количества надосадочной жидкости, не повреждая гранулы.ПРИМЕЧАНИЕ: Гранула будет очень рыхлой. Добавьте 50 мкл PBS к грануле и ресуспендируйте ее. Снова центрифугируйте пробирку при 15 000-20 000 x g в течение 15 мин. С помощью наконечника объемом 10 мкл непосредственно аспирируйте 4 мкл гранулы и перелейте ее в чистую пробирку объемом 1,5 мл (рис. 1D 1). Используйте 1 мкл промытого и концентрированного золота на сетку.ПРИМЕЧАНИЕ: Тип используемых реперных точек зависит от последующих применений. Для ПЭМ-томографии используйте золотые шарики 10 нм. Для мягкой рентгеновской томографии используйте золотые шарики размером 200 нм. Для корреляционной микроскопии используют флуоресцентные латексные шарики. Реперные точки, как правило, не нужны для экспериментов, связанных с измельчением криоFIB, так как процесс измельчения разрушит их. Потеря резкостиУстановите климатическую камеру на влажность 95% и температуру 30°C (Рисунок 1D 1). Выделите сетку пинцетом 5/15. Промойте решетки PBS и переложите их на погружной пинцет (рис. 1D2). После фиксации извлеките пинцет 5/15 и сдвиньте зажим на погружающийся пинцет. Вставьте решетку в погружную морозильную камеру, надежно закрепив зажим (Рисунок 1D3). Добавьте 1 мкл золотых реперных знаков на обратную сторону сетки (рис. 1D4). Добавьте 2-3 мкл PBS на углеродную сторону сетки. Используйте автоматическое промокание, чтобы промокнуть тыльную сторону сетки и погрузить замерзшую жидкость в жидкий этан (рис. 1D5).ПРИМЕЧАНИЕ: Для оптимального блоттинга рекомендуется иметь от 3 до 4 мкл объема на сетку. Решетки могут удерживать различное количество PBS после промывки. Отрегулируйте добавленный объем PBS с учетом ранее существовавшей задержки жидкости в сети. Рекомендуется, чтобы золотые реперные знаки были добавлены в заднюю часть сетки. Добавление спереди может привести к образованию пул золотых реперных знаков вблизи места вставки, в то время как добавление сзади приводит к более гомогенизированному раствору. Продолжительность блоттинга зависит от клеточной стоматологии сетки. 2 с для пустой сетки, 3 с для нормальной и 4 с для полной сетки соответственно. Тип погружной морозильной камеры может определять подход к промоканию: погружная морозильная камера Leica GP2 используется в этом протоколе и по умолчанию способна к автоматическому одностороннему промоканию. Компания Thermo Fisher Vitrobot выполняет автоматизированное двустороннее блоттинг, хотя это часто повреждает клетки, прикрепленные к углеродной стороне. Также возможно ручное промокание в Vitrobot, а также ручные гравитационные плунжеры.