哺乳類細胞の in situ クライオトモグラフィーのためのサンプル調製

1. グリッドの準備 注:実験計画では、プランジ凍結セッションごとに合計で最大8〜12グリッド、ウェルあたり4〜5グリッドを計画します。それを超えると、非常に長いプランジ凍結セッションにつながり、細胞ストレスの増加、氷の汚染、およびユーザーエラーを引き起こす可能性があります。 グロー放電グロー放電装置で0.39 mBar雰囲気で15 mAで45秒間グロー放電するように、適切な数のグリッドに穴あきカーボンサポートフィルムをロードします。 グリッドのカーボン側が上を向いていることを確認してください。終了したら、グリッドをろ紙で裏打ちされた清潔な容器に移します(図1A1)。注:材料が細胞に有毒でない限り、他のグリッドを使用できます(銅グリッドは除外されます)。ファインダーグリッドは、相関調査に役立ちます。他の材料で作られたグリッドも可能です。多くの研究室では、SiO2支持グリッド8,9の上に細胞を成長させ、良好な結果が得られています。 接着治療グリッド、フィブロネクチン、PBS、プレート、ピンセットをバイオセーフティキャビネットに移します。グリッドの両側を 20 μg/mL のウシフィブロネクチンで処理し、6ウェルプレートの蓋などの無菌表面に、たっぷりの大きさの付着溶液を2つマイクロピペッティングします。ドットがグリッド全体を包み込むのに十分な大きさであることを確認してください(約100μLを推奨)。注:選択した接着液で処理する前に、グリッドの正方形の中心に細胞の付着を最適化するために、ここでグリッドをフォトマイクロパターニングするオプションがあります。細胞がバーに付着する能力を下げると、イメージング可能な細胞の数が増えます。これは、クライオFIBミリングを含む実験に最適です。 5/15ピンセットを使用してグリッドを操作します。グリッドの両側を溶液で処理してください。注:他の接着溶液(フィブリノーゲン、コラーゲン、その他の細胞外マトリックス成分など)を使用できます。フィブロネクチンは、さまざまな細胞株で良好な結果が得られるため、ここで使用されます。(U2OS、HeLa、Vero、Calu-3、Tzm-bl)。5/15ピンセットは、その形状により、6ウェルプレート、35mmディッシュ、マイクロスライドの周りの操作性が向上しているため、便利です。これにより、グリッドへの機械的ストレスが軽減され、カーボン膜がより無傷になります。グリッド汚染の可能性を減らすために、開始する前に必要なすべての材料がバイオセーフティキャビネットに配置されていることを確認してください。 グリッドのアタッチウシフィブロネクチンで処理すると、グリッドは粘着性になります。5/15ピンセットを使用して、グリッドの非カーボン表面を空の皿/プレートの底にそっと触れ、ピンセットを開きます。グリッドは新しいサーフェスに簡単に取り付けられます(図1A、2)。注意: 皿/プレートの真ん中または端にグリッドを配置しないようにしてください。細胞を追加すると、細胞密度がプレートの中心に蓄積する傾向があります。これにより、グリッドのセル密度が過度になる可能性があります。或いは、3Dプリントされたグリッドホルダーを、皿/プレート12の表面に直接セルを付着させる代わりに、ここで使用されてもよい。 潜伏グリッドをフィブロネクチン付着溶液(20 μg/mL)中で30分間インキュベートします。このプロセス中にグリッドが乾燥しないように、マイクロピペット1〜2個を15分ごとにグリッドの上に直接滴下します(図1A3)。注:インキュベーション期間は、使用する接着液によって異なります。ウシフィブロネクチンの場合、推奨時間は30分です。 洗浄インキュベーション期間の後、マイクロピペッティングで余分な付着液を除去します。PBSをグリッドの上に直接マイクロピペッティング滴下してグリッドを洗浄します。これを2〜3回繰り返します。(図1A、4)。 殺菌UVライトを使用して、バイオセーフティキャビネット内のグリッドを1時間滅菌します。グリッドをUV光源にできるだけ近づけて、滅菌を最大化します(図1A5)。このプロセス中にグリッドが乾燥しないように、マイクロピペットで10分ごとにPBSをグリッドの上に直接滴下します。注:手順1.4〜1.6は同時に実行できます。 2. シードグリッド セルを数える:機械的または酵素的方法を使用して細胞を分離し、カウントします。カウントする前に、播種に使用する最適なセル数を決定します。6ウェルプレートに播種されたU2OSの場合は、ウェルあたり6 x 104 〜1.6 x 105 セルを使用します(図1B1)。注:播種する細胞の数は、細胞の種類、ウェルの表面積、使用するディッシュまたはマイクロスライド、播種からプランジ凍結までの時間、および実験計画によって異なります。セル番号の範囲をテストして、プランジ凍結時にグリッド正方形あたり0.25-1セルになる条件を特定します。セル密度が高いと熱伝達速度が低下し、ガラス化プロセスに影響を与える可能性があることに注意することが重要です。これに対抗するために、一部の研究室では、細胞凝集塊の形成を防ぐ作用を持つセルストレーナーを使用することに成功しています13。最後に、このプロトコルはカーボン層に細胞の任意付加で起因する。ターゲットアタッチメントが必要な場合は、フォトマイクロパターニングを使用できます(ステップ1.3を参照)14。 細胞と増殖培地の添加:気泡を避けながら、マイクロピペットを介して細胞をウェルに添加します(図1B2)。6ウェルプレートでは、1.5〜2.0 mLの総ウェル容量が推奨されます。注意: ボリューム全体を追加する前に、グリッドの周りを注意深く濡らすことをお勧めします。これにより、グリッドが分離してソリューション内で浮動するのを防ぐことができます。プレートを左右に静かに動かして、ウェル上での細胞の均一な分布を促進します。プレートを円運動で渦巻かせると、ウェルの中心に過剰な細胞密度が割り当てられるため、行わないでください。 インキュベーション:スライドを37°Cで適切な時間、実験デザインに従ってインキュベートしますが、これは下流のアプリケーションによって異なります。この例(HIV分子クローンのトランスフェクション)では、16〜24時間インキュベートします(図1B3)。注:インキュベーション時間が長いほど、細胞分裂サイクルが長くなります。したがって、それに応じて播種する開始セルの数を調整します。 3. トランスフェクション トランスフェクション混合物の調製:選択した細胞株へのプラスミドトランスフェクションに適したカチオン性リポソーム試薬を調製します。 このトランスフェクションの例では、1 μgの総プラスミドDNAを1ウェルあたり(6ウェルプレートで)使用し、HIViΔEnvプラスミドとpsPAX2プラスミドの比率を1:3の比率でトランスフェクションします。各ウェルについて、1 μg の DNA を 50 μL の無血清 DMEM に希釈します。マイクロピペッティングを繰り返すか、プレートを穏やかに旋回させることで、混合物を均質化します。 各ウェルについて、トランスフェクション試薬3 μLを無血清DMEMで希釈し、マイクロピペッティングまたは穏やかな旋回により混合物を再度ホモジナイズします。希釈したトランスフェクション試薬混合物全体を希釈したDNA混合物に加え(ステップ3.1.2)、室温(RT)で15分間インキュベートします(図1C1)。注:この混合物がインキュベートされている間に、ウェル内の培地を 1.5 mL の新鮮な DMEM と交換します。井戸の底からグリッドが外れないように注意してください。 トランスフェクション混合物を塗布するには、ステップ 3.1.3 の混合物 100 μL を各ウェルに滴下し、グリッド上に滴下を集中させて確実に接触させます(図 1C2)。トランスフェクションの16〜24時間後に増殖培地を交換します(図1C、3)。 4.プランジ凍結 注:ブロッティングが必要になるまで、細胞を37°Cに保ってください。さらに、プロセス全体を通して、グリッドの炭素側を必ずメモしてください。 細胞密度倒立光学顕微鏡でグリッドを確認し、各グリッドの細胞密度を記録します。注: グリッドの正方形あたり 0.25 セル未満 (またはグリッドの正方形 4 つごとに 1 つのセル) のグリッドは「空」と見なされます。グリッドの正方形あたり 0.25-1 セルのグリッドは「標準」と見なされます。グリッドの正方形ごとに 1 つ以上のセルを持つグリッドは、「フル」と見なされます。 各グリッドの細胞密度に注意して、後でプランジ凍結中にブロッティング時間を調整できるようにします。空のプレート/ディッシュに2〜3 mLのPBSを加え、37°Cに温めます。 指標の準備ダウンストリームクライオトモグラフィーアプリケーション用の金フィデューシャルを調製するには、50 μL の 10 nm 金コロイドビーズ溶液を清潔な 1.5 mL チューブにピペットで移します。2 μL の 1 mg/mL BSA をチューブに加え、マイクロピペッティングを繰り返してホモジナイズします。 チューブを15,000〜20,000 x g で15分間遠心分離します。マイクロピペットは、ペレットを乱すことなく、できるだけ多くの上清を除去します。注意: ペレットは非常に緩くなります。 50 μLのPBSをペレットに添加し、再懸濁します。チューブを15,000-20,000 x g で15分間再度遠心分離します。 10 μL チップを使用して、4 μL のペレットを直接吸引し、清潔な 1.5 mL チューブに移します(図 1D1)。グリッドあたり1 μLの洗浄濃縮金を使用します。注: 使用される指標のタイプは、下流のアプリケーションによって異なります。TEMトモグラフィーには、10nmの金ビーズを使用します。軟X線トモグラフィーには、200nmの金ビーズを使用してください。相関顕微鏡には、蛍光ラテックスビーズを使用します。基準法は、フライス加工プロセスによって破壊されるため、通常、クライオFIBミリングを含む実験には必要ありません。 吸い取り恒温槽を湿度95%、30°Cに設定します(図1D1)。5/15ピンセットを使用してグリッドを選択します。 グリッドをPBSで洗浄し、プランジピンセットに移します(図1D2)。固定したら、5/15ピンセットを取り外し、プランジピンセットのクランプをスライドさせます。 グリッドをプランジフリーザーに挿入し、クランプを固定します(図1D3)。グリッドの裏側に 1 μL の金フィデューシャルを加えます(図 1D4)。2〜3μLのPBSをグリッドのカーボン側に加えます。自動ブロッティングを使用してグリッドの裏側を吸い取り、凍結液を液体エタンに沈めます(図1D5)。注:最適なブロッティングのために、グリッドあたり3〜4 μLの容量を使用することをお勧めします。グリッドは、洗浄後に可変量のPBSを保持してもよい。PBSの追加量を調整して、グリッド上の既存の液体保持を考慮します。金の基準はグリッドの背面に追加することをお勧めします。前面から添加すると、挿入点付近に金の基準材が溜まりますが、背面から添加すると、より均質化された溶液になります。ブロッティングの持続時間は、グリッドの細胞歯科によって異なります。空の場合は 2 秒、法線の場合は 3 秒、フル グリッドの場合は 4 秒です。利用可能なプランジフリーザーの種類によって、ブロッティングへのアプローチ方法が決まります:Leica GP2プランジフリーザーは、このプロトコルで使用されるもので、デフォルトで自動片面ブロッティングが可能です。サーモフィッシャー Vitrobot は自動両面ブロッティングを行いますが、カーボン側に付着したセルに損傷を与えることがよくあります。Vitrobotでの手動ブロッティングや、手動重力プランジャーも可能です。