הכנת דגימה לקריוטומוגרפיה באתרו של תאי יונקים

1. הכנת הרשת הערה: בתכנון הניסוי, תכננו מקסימום של 8-12 רשתות בסך הכל לכל מפגש הקפאה של צלילה ו-4-5 רשתות לכל באר. יותר מזה יוביל לסשן ארוך מאוד של הקפאת צלילה, מה שעלול לגרום ללחץ מוגבר על התא, זיהום קרח וטעויות משתמש. פריקה זוהרתטען מספר מתאים של רשתות עם סרט תמיכת פחמן מחורר כדי להיות זוהר נפלט ב 15 mA במשך 45 שניות ב 0.39 mBar אטמוספירה במכשיר פריקה זוהר. ודא שצד הפחמן של הרשת פונה כלפי מעלה. בסיום, העבירו את הרשתות למכל נקי מרופד בנייר סינון (איור 1A1).הערה: ניתן להשתמש ברשתות אחרות כל עוד החומר אינו רעיל לתאים (שאינו כולל כל רשת נחושת). רשתות Finder שימושיות למחקרי מתאמים. רשתות עשויות מחומרים אחרים אפשריות גם כן. מעבדות רבות השיגו תוצאות טובות בגידול תאים על גבי רשתות תמיכה SiO2 8,9. טיפול דבקהעבירו את הרשתות, פיברונקטין (fibronectin), PBS, צלחות ופינצטה לארון בטיחות ביולוגית. טפל בשני צידי הרשתות עם פיברונקטין בקר 20 מיקרוגרם / מ”ל על ידי מיקרופיפטין שתי נקודות בגודל נדיב של תמיסה דבקה על משטח סטרילי, כגון מכסה של צלחת 6 בארות. ודא שהנקודות גדולות מספיק כדי לעטוף את הרשת כולה (מומלץ בסביבות 100 μL).הערה: לפני הטיפול בתמיסה הדבקה שנבחרה, קיימת כאן אפשרות של מיקרו-תבניות צילום של הרשת כדי לייעל את החיבור של תאים במרכז ריבועי הרשת. הפחתת היכולת של תאים להיצמד לסורגים תגדיל את מספר התאים הניתנים לצילום. זה אידיאלי לניסויים הכוללים כרסום cryoFIB. השתמש בפינצטה 5/15 כדי לתפעל את הרשתות. הקפד לטפל בשני צידי הרשת בתמיסה.הערה: ניתן להשתמש בתמיסות דבק אחרות (פיברינוגן, קולגן, רכיבי מטריצה חוץ-תאיים אחרים וכו’). פיברונקטין משמש כאן, כפי שהוא נותן תוצאות טובות עם מגוון רחב של קווי התא. (U2OS, HeLa, Vero, Calu-3, Tzm-bl). פינצטה 5/15 שימושית מכיוון שהגיאומטריה שלה מאפשרת יכולת תמרון משופרת סביב לוחות 6 בארות, צלחות 35 מ”מ ומגלשות מיקרו. התוצאה היא פחות לחץ מכני על הרשתות וסרט פחמן שלם יותר. ודא שכל החומרים הדרושים ממוקמים בארון הבטיחות הביולוגית לפני תחילת העבודה, מכיוון שהדבר מפחית את האפשרות לזיהום רשת. חיבור רשתותלאחר הטיפול בפיברונקטין בקר, הרשת תהפוך לדביקה. בעזרת פינצטה 5/15, געו בעדינות במשטח נטול הפחמן של הרשת בתחתית צלחת/צלחת ריקה ופתחו את הפינצטה. הרשת אמורה להתחבר בקלות למשטח החדש (איור 1A2).הערה: נסו להימנע ממיקום רשתות במרכז הישיר או בשולי המנה/צלחת. בעת הוספת תאים, קיימת נטייה להצטברות צפיפות תאים במרכז הצלחת. זה יכול לגרום לרשתות עם צפיפות תאים מוגזמת. לחלופין, ניתן להשתמש כאן במחזיקי רשת מודפסים בתלת-ממד במקום לחבר תאים ישירות לפני השטח של המנה/צלחת12. דגירהדוגרים על הרשתות למשך 30 דקות בתמיסה הדבקת פיברונקטין (20 מיקרוגרם/מ”ל). כדי להבטיח שהרשתות לא יתייבשו במהלך התהליך הזה, מיקרופיפטה 1-2 טיפות של תמיסה נצמדת יותר ישירות על גבי הרשתות כל 15 דקות (איור 1A3).הערה: תקופת הדגירה תשתנה בהתאם לתמיסה הדבקה בה נעשה שימוש. עבור פיברונקטין בקר, הזמן המומלץ הוא 30 דקות. כביסהלאחר תקופת הדגירה, יש לסלק את עודפי התמיסה הנצמדת באמצעות מיקרופיפטינג. שטפו את הרשתות על ידי טיפות מיקרופיפטינג של PBS ישירות על גבי הרשתות. חזור על פעולה זו 2-3 פעמים. (איור 1A4). עיקורהשתמש באור UV כדי לעקר את הרשתות בארון הבטיחות הביולוגית למשך שעה אחת. מקמו את הרשתות קרוב ככל האפשר למקור העל-סגול כדי למקסם את העיקור (איור 1A5). כדי להבטיח שהרשתות לא יתייבשו במהלך תהליך זה, מיקרופיפטה 1-2 טיפות PBS ישירות על גבי הרשתות כל 10 דקות.הערה: ניתן לבצע את שלבים 1.4-1.6 בו-זמנית. 2. רשתות זריעה ספירת תאים:נתק וספור את התאים בשיטות מכניות או אנזימטיות. קבע את מספר התאים המיטבי לשימוש לזריעה לפני הספירה. עבור U2OS שנזרע בצלחת של 6 בארות, השתמש בכל מקום בין 6 x 104 ל 1.6 x 105 תאים לכל באר (איור 1B1).הערה: מספר התאים שנזרעו ישתנה בהתאם לסוג התא, שטח הפנים של הבאר, צלחת או מיקרו-מגלשה בשימוש, הזמן בין הזריעה להקפאה והקפאה, ותכנון הניסוי. בדוק טווח של מספרי תאים כדי לזהות תנאים שיובילו ל- 0.25-1 תאים לכל ריבוע רשת בזמן הקפאה. חשוב לציין כי צפיפות תאים גבוהה מפחיתה את מהירות העברת החום ועלולה להשפיע על תהליך הוויטריפיקציה. כדי להילחם בכך, כמה מעבדות מצאו הצלחה בשימוש במסננות תאים, הפועלות למניעת היווצרות גושי תאים13. לבסוף, פרוטוקול זה גורם לחיבור אקראי של תאים לשכבת הפחמן. אם יש צורך בקובץ מצורף ממוקד, ניתן להשתמש במיקרו-תבניות צילום (ראה שלב 1.3)14. הוספת תאים ומדיום גדילה: הוסיפו תאים באמצעות מיקרופיפטה לבארות, תוך הימנעות מבועות (איור 1B2). בצלחת 6 בארות, נפח באר כולל של 1.5-2.0 מ”ל מומלץ.הערה: מומלץ להרטיב היטב סביב הרשתות לפני הוספת כל הנפח. פעולה זו תסייע למנוע התנתקות של רשתות וציפה בפתרון. הזיזו בעדינות את הצלחת מצד לצד כדי להקל על פיזור תאים הומוגני על הבאר. אין לסובב את הצלחת בתנועה סיבובית, מכיוון שהדבר יגרום להקצאת צפיפות תאים מוגזמת במרכז הבאר. דגירה: לדגור על המגלשות ב 37 מעלות צלזיוס לזמן מתאים על פי התכנון הניסיוני, אשר יהיה תלוי ביישומים במורד הזרם. לדוגמה זו (טרנספקציה של שיבוטים מולקולריים של HIV), דגירה בין 16-24 שעות (איור 1B3).הערה: זמני דגירה ארוכים יותר יגרמו למחזורי חלוקת תאים רבים יותר. לכן, התאם את מספר התאים ההתחלתי לזריעה בהתאם. 3. טרנספקציה הכנת תערובת טרנספקציה:הכן מגיב ליפוזום קטיוני מתאים עבור טרנספקציה פלסמיד לתוך קו התא שנבחר. בדוגמה זו של טרנספקציה, השתמש ב- 1 מיקרוגרם של DNA פלסמיד כולל לכל באר (בצלחת 6 בארות) כדי להיות נגוע ביחס של 1:3 בין פלסמיד HIViΔEnv לפלסמיד psPAX2. עבור כל באר, לדלל 1 מיקרוגרם של DNA לתוך 50 μL של DMEM ללא סרום. הומוגניזציה של התערובת באמצעות מיקרופיפטינג חוזר ונשנה או ערבול עדין של הצלחת. עבור כל באר, לדלל 3 μL של מגיב transfection ב DMEM ללא סרום, ולאחר מכן הומוגנית את התערובת שוב על ידי micropipetting או ערבול עדין. הוסיפו את כל תערובת מגיב הטרנספקציה המדולל לתערובת הדנ”א המדולל (שלב 3.1.2) ודגרו בטמפרטורת החדר (RT) במשך 15 דקות (איור 1C1).הערה: בזמן שתערובת זו דוגרת, החלף את המדיה בבארות ב- 1.5 מ”ל DMEM טרי. היזהרו שלא לעקור את הרשתות מתחתית הבאר. כדי ליישם את תערובת הטרנספקציה, פיפטה 100 μL של התערובת משלב 3.1.3 טיפתית לכל באר, תוך ריכוז הטיפות מעל הרשתות כדי להבטיח מגע (איור 1C2). שנה את מדיום הגידול 16-24 שעות לאחר הטרנספקציה (איור 1C3). 4. לצלול הקפאה הערה: שמור על התאים בטמפרטורה של 37°C עד שיידרש לצורך ניקוי. בנוסף, הקפידו לרשום את צד הפחמן של הרשתות לאורך כל התהליך. צפיפות תאיםבדקו את הרשתות במיקרוסקופ אופטי הפוך ושימו לב לצפיפויות התאים בכל רשת.הערה: רשתות עם פחות מ- 0.25 תאים לריבוע רשת (או תא אחד בכל 4 ריבועי רשת), נחשבות ‘ריקות’. רשתות עם 0.25-1 תאים לכל ריבוע רשת נחשבות ‘נורמליות’. רשתות עם יותר מתא אחד לכל ריבוע רשת נחשבות ‘מלאות’. שים לב לצפיפות התאים בכל רשת כדי לאפשר חיוג של זמני כתמים מאוחר יותר במהלך הקפאת הצניחה. מוסיפים 2-3 מ”ל PBS לצלחת/צלחת ריקה ומחממים ל-37°C. הכנת פידוקיאליםכדי להכין פידוקיאלים של זהב ליישומי קריוטומוגרפיה במורד הזרם, פיפטה 50 μL של תמיסת חרוזי זהב קולואידית 10 ננומטר לתוך צינור נקי של 1.5 מ”ל. הוסף 2 μL של 1 מ”ג / מ”ל BSA לצינור הומוגניזציה על ידי micropipetting שוב ושוב. צנטריפוגה את הצינור ב 15,000-20,000 x גרם במשך 15 דקות. מיקרופיפטה כדי להסיר כמה שיותר מהסופרנאטנט מבלי להפריע לכדורית.הערה: הגלולה תהיה רופפת מאוד. הוסף 50 μL של PBS לגלולה והשהה מחדש. צנטריפוגה את הצינור שוב ב 15,000-20,000 x גרם במשך 15 דקות. בעזרת קצה של 10 μL, שאפו ישירות 4 μL של הכדורית, והעבירו אותה לצינור נקי של 1.5 מ”ל (איור 1D1). יש להשתמש ב-1 מיקרוליטר של הזהב השטוף והמרוכז בכל רשת.הערה: סוג הפידוקיאלים שבהם נעשה שימוש תלוי ביישומים במורד הזרם. עבור טומוגרפיה TEM, השתמש חרוזי זהב 10 ננומטר. עבור טומוגרפיה רנטגן רכה, להשתמש חרוזי זהב 200 ננומטר. למיקרוסקופ מתאם, השתמשו בחרוזי לטקס פלואורסצנטיים. Fiducials בדרך כלל אינם נחוצים לניסויים הכוללים כרסום cryoFIB, מכיוון שתהליך הכרסום יהרוס אותם. כתםהגדר את התא הסביבתי ללחות של 95% ול-30°C (איור 1D1). בחר רשת באמצעות פינצטה 5/15. שטפו את הרשתות עם PBS והעבירו אותן לפינצטה צוללת (איור 1D2). לאחר האבטחה, הסר את הפינצטה 5/15 והחלק את המהדק על הפינצטה הצוללת. הכניסו את הרשת למקפיא הצלילה, תוך שמירה על מהדק מאובטח (איור 1D3). הוסיפו 1 מיקרוליטר של זהב לצד האחורי של הרשת (איור 1D4). הוסף 2-3 μL של PBS לצד הפחמן של הרשת. השתמשו בכתמים אוטומטיים כדי לכתם את הצד האחורי של הרשת ולקפוא לתוך אתאן נוזלי (איור 1D5).הערה: מומלץ שיהיה בין 3-4 מיקרוליטר נפח לרשת לניקוי אופטימלי. רשתות עשויות לשמור על כמות משתנה של PBS לאחר הכביסה. התאם את הנפח הנוסף של PBS כדי לקחת בחשבון שימור נוזלים קיים מראש ברשת. מומלץ להוסיף את פידוקיות הזהב לחלק האחורי של הרשת. חיבור מלפנים יכול לגרום לבריכות של זהב סמוך לנקודת ההחדרה, בעוד שחיבור מאחור מביא לתמיסה הומוגנית יותר. משך ההדבקה תלוי ברפואת השיניים התאית של הרשת. 2 שניות עבור רשתות ריקות, 3 שניות עבור רגיל ו- 4 שניות עבור רשתות מלאות, בהתאמה. סוג מקפיא הצלילה הזמין עשוי לקבוע כיצד ניגשים לניקוי: מקפיא הצלילה Leica GP2 הוא זה המשמש בפרוטוקול זה והוא מסוגל לבצע הכתמה חד צדדית אוטומטית כברירת מחדל. Thermo Fisher Vitrobot מבצע ניקוי דו-צדדי אוטומטי, אם כי לעתים קרובות זה פוגע בתאים המחוברים לצד הפחמן. כתם ידני בויטרובוט אפשרי גם, כמו גם בוכנות כבידה ידניות.