Таргетная метаболомика на редких первичных клетках

Метаболизм – это важнейший биологический процесс, происходящий во всех живых клетках. Метаболические процессы включают в себя обширную сеть биохимических реакций, которые жестко регулируются и взаимосвязаны, позволяя клеткам вырабатывать энергию и синтезировать необходимые^{биомолекулы.} Чтобы понять функцию метаболических сетей, исследователи измеряют уровни низкомолекулярных промежуточных продуктов в клетках. Эти промежуточные продукты служат важными индикаторами метаболической активности и могут дать важную информацию о клеточной функции.

Масс-спектрометрия (МС) является наиболее популярным выбором для специфического обнаружения метаболитов в сложных образцах ^1,2. Ядерный магнитный резонанс (ЯМР) имеет преимущества в абсолютном количественном определении соединений и выяснении структуры, но МС часто позволяет разрешать большее количество компонентов в сложных смесях, таких как биожидкости или клеточные экстракты. Чаще всего РС сочетается с предварительным разделением соединения с помощью капиллярного электрофореза (КЭ), газовой хроматографии (ГХ) или жидкостной хроматографии (ЖХ)³. Выбор платформы сепарации в основном определяется диапазоном целевых метаболитов и типом образца, а в реальных условиях — доступностью оборудования и опыта. Все три сепарационные платформы имеют широкий и перекрывающийся диапазон подходящих метаболитов, но различные ограничения. Короче говоря, КЭ может разделять только заряженные молекулы и требует большого опыта для осуществления надежного анализа большого количества образцов⁴. ГХ ограничен молекулами, которые достаточно малы и аполярны, чтобы испариться перед разложением³. Учитывая все коммерчески доступные колонки LC, любые два метаболита могут быть разделены с помощью этой технологии⁵. Тем не менее, многие методы LC обладают меньшей разрешающей способностью, чем методы CE или GC аналогичной длины.

Типичное количество исходного материала для метаболомных измерений обычно находится в диапазоне от 5 x 10⁵ до 5 x 10⁷ клеток на образец, 5-50 мг влажной ткани или 5-50 мкл биологической жидкости⁶. Однако при работе с первичными клетками редких типов клеток, таких как, например, гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) или циркулирующие опухолевые клетки, может быть сложно получить такое количество исходного материала. Эти клетки часто присутствуют в очень малых количествах и не могут быть культивированы без ущерба для критически важных клеточных характеристик.

ГСК и мультипотентные клетки-предшественники (MPP) являются наименее дифференцированными клетками кроветворной системы и непрерывно производят новые клетки крови на протяжении всей жизни организма. Регуляция кроветворения имеет клиническое значение при таких состояниях, как лейкемия и анемия. Несмотря на свою важность, ГСК и МПП являются одними из самых редких клеток в кроветворной системе. От одной мыши, как правило, можно выделить около 5000 ГСК ^7,8,9. Поскольку традиционные методы метаболомики требуют большего количества входного материала, для анализа редких типов клеток^10,11 часто приходилось объединять клетки нескольких мышей.

Здесь мы стремились разработать протокол, который позволяет измерять метаболиты всего в 5000 клетках на образец, чтобы обеспечить генерацию метаболомных данных из ГСК одной мыши¹². В то же время этот метод позволяет генерировать несколько репликаций из одной мыши для более распространенных типов клеток, таких как лимфоциты. Такой подход уменьшает количество животных, необходимых для данного проекта, тем самым способствуя «3R» (сокращение, замена, уточнение) экспериментов на животных.

Метаболиты в клетках могут иметь очень высокую скорость оборота, часто порядка¹³ секунд. Тем не менее, подготовка образцов для флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS) может занять несколько часов, а сама сортировка FACS может занять от нескольких минут до нескольких часов, что приводит к потенциальным изменениям в метаболоме из-за нефизиологических условий. Некоторые из реагентов, используемых в этом протоколе (например, лизисный буфер аммония-хлорида-калия [ACK]), могут иметь аналогичные эффекты. Эти условия могут вызывать клеточный стресс и влиять на уровни и соотношение метаболитов в клетках, что приводит к неточным или смещенным измерениям клеточного метаболизма 14,15,16. Метаболические изменения, вызванные пробоподготовкой, иногда называют артефактами сортировки. Длительные протоколы пищеварения и жесткие реагенты, которые могут потребоваться для получения одноклеточной суспензии из твердых или жестких тканей, могут усугубить эту проблему. Какие изменения могут произойти, скорее всего, зависит от типа клетки и условий обработки. Точная природа изменений остается неизвестной, так как метаболическое состояние ненарушенных клеток в живой ткани не может быть измерено.

Представленный здесь протокол включает в себя несколько ключевых отличий по сравнению с традиционными методами, а именно: использование 5 г/л NaCl в качестве жидкости оболочки, сортировка непосредственно в буфер экстракции, введение больших объемов образцов для жидкостной хромато-масс-спектрометрии с гидрофильным взаимодействием (HILIC-MS) и использование целевого количественного определения, строгое использование внутренних стандартов и фонового контроля (рис. 1). Этот протокол обладает потенциалом для сохранения различий между типами клеток, а также между лекарственным лечением и контролем транспортных средств в значительной степени¹². Даже для культивируемых клеток он выгодно отличается от альтернативных подходов, таких как более традиционное центрифугирование и ручное удаление надосадочной жидкости. Однако, поскольку артефакты сортировки все еще могут возникать, данные следует интерпретировать с осторожностью. Несмотря на это ограничение, протокол представляет собой значительное улучшение в области метаболического профилирования, позволяя проводить более точные и всесторонние измерения клеточного метаболизма в редких первичных клетках¹².

Возможность надежно измерять широкие метаболические профили в редких первичных клетках открывает дверь для новых экспериментов в биомедицинских исследованиях с участием этих клеток. Например, было показано, что метаболически опосредованная регуляция в ГСК влияет на способность к самообновлению в состоянии покоя, что имеет значение для анемии и лейкемии^11,17. В циркулирующих опухолевых клетках, полученных от пациентов, были показаны различия в экспрессии метаболических генов между опухолью и соседними клетками^18,19. Этот протокол теперь позволяет исследователям систематически изучать эти различия на метаболическом уровне, который обычно рассматривается как более близкий к клеточному фенотипу, чем экспрессия генов.