호르몬, 대사 및 전기 조절 연구를 위한 표적 시상하부 뉴런의 분리

알림: 일반적인 view 실험 절차는 그림 1A에 그래픽으로 설명되어 있습니다. 이 연구에서 수행된 모든 마우스 실험은 우리 기관의 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았습니다. 우리는 수의사의 보살핌 하에 AAALAC(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International) 승인 사육장에 보관된 3개월 된 C57BL6/J 마우스를 사용했습니다. 생쥐는 12시간의 명암 주기로 큰 우리에서 살았고 임의로 먹이를 먹었습니다. 1. 임신 및 임신 확인 번식을 위해 관심있는 배경과 유전자형의 마우스를 배치하십시오. 임신하기 전에 여성의 날짜와 체중을 기록하십시오. 6 시간 후, 프로브로 플라크에 대한 여성을 검사하십시오. 플라크가 있으면 여성과 남성을 분리하십시오. 플라크가 없으면 다음날까지 새장에 암컷을 보관 한 다음 마우스를 분리하십시오. 임신 후 7일, 10일, 14일에 여성의 체중을 측정하여 임신을 확인합니다. 2. 매체, 24웰 플레이트 및 재료 준비 세포 분리 당일, 즉시 사용 가능한 폴리-D-라이신 코팅된 유리 커버슬립( 재료 표 참조)을 다음과 같이 24웰 플레이트에 넣습니다.생물학적 후드 아래에서 70 % 에탄올로 15 개의 커버 슬립이 들어있는 단일 패키지를 멸균하고 건조시킵니다. 포장을 개봉하고 커버슬립을 60mm 플레이트에 넣습니다. 플레이트를 수평으로 흔들어 커버슬립을 분리합니다. 그런 다음 플레이트를 뒤집어 24웰 플레이트의 웰에 넣을 단일 커버슬립을 집어 올립니다. 1.0mL의 멸균 Hank’s Balanced Salt Solution(HBSS)으로 5분 동안 커버슬립을 한 번 세척합니다. 그 동안 다음과 같이 20.0mL의 도금 매체를 준비합니다: 18.31mL의 BME(Basal Medium Eagle, + Earle’s Salts)에 1.0mL의 열 비활성화 태아 소 혈청(FBS)을 보충하고, 200μL의 피루브산나트륨(100x 스톡에서), 200μL의 글루타민(200nM 스톡에서) 및 100μL의 페니실린/스트렙토마이신(200x 스톡에서). 웰의 HBSS를 1.0mL의 도금 배지로 교체하고 플레이트를 37°C의 인큐베이터에 놓습니다. 분젠 버너를 사용하여 파스퇴르 피펫 3개를 직경이 줄어드는 불 광택을 냅니다. 한 손으로 피펫을 잡고 팁을 화염에 삽입하고 신속하게 제거하십시오. 팁이 부드러워지고 직경이 원하는 직경(눈으로 평가)으로 줄어들 때까지 이 과정을 반복합니다. 3. 신경 조직 해리를 위한 시약 준비, 신경 해리 키트의 지시에 따름 Digestion Buffer 1을 실온에서 데운 후 Enzyme Mix 1 50 μL와 Buffer 1 1.91 mL를 혼합하여 Enzyme Mix 1을 준비하고, Enzyme Mix 2 15 μL와 Digestion Buffer 2 30 μL를 혼합하여 Enzyme Mix 2를 준비합니다. 혼합물은 모든 배아의 뇌 조직에 사용하기에 충분합니다. HBSS에서 0.5% 소 혈청 알부민(BSA)을 준비합니다(예: HBSS 50.0mL에 0.25g). 4. 배아 추출 2 개의 직선 미세 집게, 1 개의 곡선 점 겸자 및 1 쌍의 미세 수술 용 가위를 오토 클레이브하고 사용하기 전에 70 % 에탄올로 살균하십시오. 그런 다음 페트리 접시를 HBSS로 채웁니다. CO2 챔버에서 E14-E16 임신 댐 1개를 안락사시키고 자궁경부 탈구를 수행합니다.알림: 다음 단계는 무균 상태에서 후드 아래에서 수행해야 합니다. 70 % 에탄올로 복부를 소독하십시오. 수술 용 가위와 집게로 흉곽의 xiphoid 과정까지 치골 symphysis에서 복강을 잘라냅니다. 자궁 뿔을 추출하고 얼음처럼 차가운 HBSS로 채워진 100mm 플레이트에 넣고 철저히 씻으십시오. 미세한 집게로 자궁에서 모든 배아를 추출하고 분리하십시오. 미세한 수술용 가위 및/또는 집게로 배아를 빠르게 참수합니다. HBSS로 채워진 60mm 페트리 접시에 헤드를 놓습니다. 5. 시상하부 추출, 수집 및 조직 해리 뇌를 고정하기 위해 안구강에 미세한 집게를 하나 놓습니다. 다른 미세한 집게를 사용하여 뇌가 보일 때까지 껍질을 벗겨 피부와 두개골을 제거합니다. 흰색 모양에 따라 뇌를 다른 조직과 구별하십시오. 피부와 두개골은 분홍색이며 혈관 구조가 풍부합니다. 구부러진 점 집게를 사용하여 두개골에서 뇌를 제거하고 후각 구근에서 뇌를 거꾸로 뒤집어 퍼냅니다. 이제 피질은 복부이고 시상 하부는 상부 표면에서 등쪽으로 보입니다 (그림 1B). 구부러진 집게를 사용하여 뇌가 하얗고 깨끗해 보일 때까지 수막과 혈관 층을 제거합니다. 구부러진 집게를 사용하여 시상 하부 영역을 뇌의 나머지 부분과 분리하십시오. 시상 하부를 3-4 개의 작은 조각으로 자르고 피펫으로 조각을 15mL 튜브에 옮깁니다. 튜브가 얼음 위에 있는 동안 다른 배아에 대해 단계를 반복합니다. 튜브에 6.0mL의 HBSS를 채우고 조직이 가라앉도록 하고 상층액을 제거한 다음 효소 혼합물 1을 추가합니다. 조직을 방지하기 위해 튜브를 부드럽게 혼합하고 교반하십시오. 튜브를 37°C 수조에서 15분 동안 인큐베이션하고 5분마다 조직을 교반하여 조직을 재현탁시킵니다. 15분 후, 효소 믹스 2 30 μL를 추가합니다. 가장 큰 직경(<1mm)의 피펫 파스퇴르를 사용하여 뇌 조직을 해리합니다. 기포를 형성하지 않고 10배 위아래로 피펫. 수조에서 37°C에서 10분 동안 배양합니다. 튜브를 부드럽게 저어 5분마다 조직을 다시 현탁시킵니다. 10분 후 나머지 15μL의 효소 믹스 2를 추가합니다. 기포를 형성하지 않고 직경이 감소하는 다른 두 개의 내화 연마 피펫과 조직을 위아래로 10배 분리합니다. 해리된 조직이 있는 튜브에 즉시 10.0mL의 HBSS-0.5% BSA를 넣고 실온에서 10분 동안 300× g 에서 원심분리합니다. 상청액을 흡인하고 세포 펠릿을 1.0mL의 HBS-0.5% BSA에 재현탁합니다. 6. 세포 계수 HBSS-0.5% BSA를 사용하여 세포 현탁액을 1:5로 희석합니다. 희석된 세포 현탁액 10μL를 Neubauer 계수 챔버에 넣습니다. 명시야 현미경으로 4개의 챔버 모서리 사각형에 있는 세포만 계산합니다. 평균을 계산하고 5 × 104를 곱합니다.알림: 셀 분리를 진행하려면 >106 개의 셀이 있는지 확인하십시오. 최적의 셀 번호는 107입니다. 7. 네거티브 선택 참고: 음성 선택을 통해 사용자는 신경 세포와 비신경 세포를 분리하여 순수한 1차 뉴런 배양을 얻을 수 있습니다. 미리 냉각 된 솔루션을 사용하십시오. 세포 현탁액을 300 × g 에서 3 분 동안 원심 분리합니다 (원심 분리는 최대 10 분까지 연장 될 수 있음). 상청액을 부드럽게 흡인하고 펠릿을 HBSS-0.5% BSA 80μL에 10 7개 세포의 농도 로 재현탁합니다. 20 μL의 비신경 세포 비오틴-항체 칵테일을 첨가하고 4 °C에서 5분 동안 배양합니다. 세포를 세척하여 유리 항체를 제거하고 2.0mL의 HBSS-0.5% BSA로 300× g 에서 3분 동안 원심분리합니다. 상층액을 부드럽게 흡인하고 펠릿을 80μL의 HBSS-0.5% BSA에 재현탁합니다. 20μL의 안티비오틴 마이크로비드를 넣고 잘 섞은 다음 4°C에서 10분 동안 배양합니다. 최대 10개의7 개 셀에 대해 0.5mL의 HBSS-0.5% BSA를 추가하고 마그네틱 컬럼이 준비될 때까지 기다립니다. 8. 자기 분리, 네거티브 선택 참고: 자기 분리는 신경 세포에서 비신경 세포를 분리할 수 있는 중요한 단계입니다. 뉴런 및 비뉴런 세포를 포함하는 샘플은 자기장을 통과하고 비오틴-항체-자성 비드 복합체에 결합된 비뉴런 세포는 컬럼에 갇힙니다(그림 1C). 유리 뉴런 세포는 컬럼을 통해 용리되고 15mL 튜브에 수집됩니다. 도 1C에 도시된 바와 같이 분리기 및 MS 컬럼을 사용하여 스탠드(키트에 포함됨)를 준비한다. 컬럼을 열고 셀을 분리할 준비가 된 경우에만 스탠드를 설치하십시오. 0.5mL의 HBSS-0.5% BSA로 컬럼을 헹굽니다. 용액이 떨어지지 않을 때까지 기다리십시오. 신경 세포를 수집하려면 컬럼 아래에 15mL 튜브를 놓고 0.5mL의 세포 현탁액을 컬럼에 통과시킵니다. 물방울이 멈출 때까지 튜브에 용리액을 수집합니다. 잔류 뉴런 세포를 포획하기 위해, 컬럼을 HBSS-0.5% BSA의 3 x 0.5 mL로 세척하였다. 비신경 세포를 수집하려면 자석에서 컬럼을 제거하고 새 15ml 튜브 안에 넣습니다. 1.0mL의 HBSS–0.5% BSA를 컬럼에 추가하고 플런저를 사용하여 자기적으로 표지된 비뉴런 세포를 수집합니다. 신경 세포와 비신경 세포를 300 × g 에서 3분 동안 원심분리합니다. 상청액을 부드럽게 흡인하고 1.0mL의 HBSS-0.5% BSA에 세포를 재현탁합니다. 섹션 6의 앞부분에서 설명한 대로 셀을 계산합니다. 필요한 경우, 비뉴런 세포를 24-웰 플레이트에 플레이트; 그렇지 않으면 폐기하십시오. 9. 포지티브 선택 참고: 순수한 신경 세포 현탁액이 얻어지면 표적 세포를 분리하기 위해 양성 선택이 수행됩니다. 세포는 표면 항원에 대한 특이적 비오틴 접합 항체를 사용하여 분리할 수 있다. 항체는 항-비오틴 마그네틱 비드에 의해 인식됩니다. 세포 현탁액을 컬럼을 통해 흐르게 하면 관심 있는 세포만 자기장에 갇히게 됩니다. 순수한 신경 세포 현탁액을 300 × g 에서 3분 동안 원심분리합니다. 상층액을 부드럽게 흡인하고 펠릿을 80μL의 HBSS-0.5% BSA에 재현탁합니다. 제조업체의 지침에 따라 특정 항체를 추가하고 4°C에서 10분 동안 배양합니다.참고: LepR을 발현하는 세포를 찾는 경우 0.50μg/106개 세포의 농도로 Mouse Leptin R Biotinylated Antibody(재료 표 참조)를 제안합니다. 과잉 항체를 2.0mL의 HBSS-0.5% BSA로 씻어내고 300× g 에서 3분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 80μL의 HBSS-0.5% BSA에 펠릿을 재현탁하고 20μL의 항비오틴 마이크로비드를 추가합니다. 4°C에서 10분 동안 배양합니다. 107 셀마다 0.5 mL의 HBSS-0.5 % BSA를 추가하고 자기 컬럼이 준비 될 때까지 기다립니다. 10. 자기 분리, 포지티브 선택 분리기와 MS 컬럼이 있는 스탠드를 준비합니다. 0.5mL의 HBSS-0.5% BSA로 MS 컬럼을 헹굽니다. 물방울이 멈출 때까지 기다리십시오. 15 mL 튜브를 컬럼 아래에 놓고, 0.5 mL의 세포 현탁액을 컬럼을 통해 통과시키고, 비특이적 신경세포를 포함하는 용출액을 수집한다. 잔류 비특이적 뉴런 세포의 컬럼을 세척하기 위해, 3 x 0.5 mL의 HBSS-0.5% BSA로 세척한다. 자석에서 컬럼을 제거하고 새 15mL 튜브에 넣고 1.0mL의 HBSS-0.5% BSA를 추가합니다. 플런저를 사용하여 표적 세포를 씻어냅니다. 두 튜브를 300 × g 에서 3분 동안 원심분리합니다. 상층액을 부드럽게 제거하고 0.5mL의 도금 배지에 다시 현탁합니다. 섹션 6에서 설명한 대로 셀을 계산합니다. 섹션 2에 기재된 바와 같이 미리 제조된 24-웰 플레이트에서 양성 대조군으로서 표적 세포 및 음성 대조군으로서 비특이적 세포 모두를 플레이트하고, 5% CO2, 9% O2 및 95% 습도에서 37°C에서12시간 동안 배양한다. 11. 세포 배양 유지 19.2mL의 신경 배양 배지, 400μL의 B27 보충제(50x 스톡에서), 200μL의 글루타민(200μM 스톡에서) 및 100μL의 페니실린/스트렙토마이신(200x 스톡에서)으로 20mL의 배양 배지를 준비합니다. 뉴런 또는 비뉴런 세포를 포함하는 24웰 플레이트에서 도금 매체를 교체합니다. HBSS 2 x 1.0mL로 세척합니다. 배양 배지 1.0mL를 추가합니다. 0.5mL의 기존 배지를 0.5mL의 새 배지로 교체하여 2/3일마다 매체를 새로 고칩니다.참고: 세포는 배양 중에 유지될 수 있으며 시험관 내에서 최대 21일 동안 사용할 수 있습니다(DIV21). 12. 뉴런 면역형광염색 염색하기 12시간 전에, 50/50 메탄올 및 아세톤으로 이루어진 용액을 제조하고, 이를 -20°C에서 밤새 냉각시켰다. 24웰 플레이트에서 뉴런을 2 x 1.0mL의 1x 인산염 완충 식염수(PBS)로 5분 동안 세척합니다. PBS 용액을 50/50 용액 1.0mL로 교체하고 얼음에서 20분 동안 배양합니다. 1x PBS로 3 x 5분 동안 세척합니다. 실온에서 1시간 동안 1x PBS에서 3% BSA로 뉴런을 차단합니다. 제조업체의 지침에 언급된 항체 농도를 사용하여 1x PBS의 3% BSA에서 1차 항체 용액을 준비합니다. 사용된 항체 및 농도는 재료 표에 나열되어 있습니다. 블로킹 용액을 1차 항체 용액으로 교체하고 4°C에서 밤새 인큐베이션합니다. 세포를 1x PBS로 3 x 10분 동안 세척합니다. 제조업체의 지침에 따라 항체 농도를 사용하여 1x PBS에 3% BSA가 포함된 2차 항체 용액을 준비합니다. 사용된 2차 항체는 재료 표에 나열되어 있습니다. 세포를 실온에서 1시간 동안 2차 항체 용액과 함께 배양합니다. 세포를 1x PBS로 3 x 10분 동안 세척합니다. 장착 절차 중에 뉴런을 1x PBS에 그대로 두십시오. 현미경 슬라이드에 장착 매체(핵 식별을 위한 4′,6-diamidino-2-phenylindole 포함 또는 제외)를 작은 방울로 떨어뜨립니다. 집게로 뉴런이 들어 있는 유리 커버슬립 하나를 추출하고 커버슬립의 측면을 종이 티슈에 두드려 초과 PBS를 건조시킵니다. 장착 매체의 커버슬립을 뒤집어 뉴런이 현미경 슬라이드를 향하고 있는지 확인합니다. 티슈 페이퍼로 여분의 장착 매체를 부드럽게 누르고 제거합니다. 현미경 슬라이드는 명시야 또는 컨포칼 현미경으로 분석할 준비가 되었습니다.