JoVE Journal > Immunology and Infection
概要
Abstract
Introduction
Protocol
結果
Discussion
開示
Acknowledgements
Materials
参考文献
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
免疫学と感染

Nötralizasyon Testi Yoluyla SARS-CoV-2'ye Karşı Humoral İmmün Yanıtları İzlemek İçin Moleküler Bir Araç Olarak Psödotiplenmiş Virüsler

Published: November 21, 2023
doi:
10.3791/65658
, , , , , , , , , , , ,
1Department of Neuroscience, Biomedicine and Movement,University of Verona, 2Laboratory of Molecular Neurovirology, Faculty of Health Science,University of Brasília, 3Viral Pseudotype Unit, Medway School of Pharmacy,Universities of Kent and Greenwich at Medway

概要

Psödotipli virüsler (PV’ler), otantik virüsleri işlemekten daha güvenli koşullar altında konak-virüs etkileşimlerini incelemek için kullanılan replikasyon kusurlu virionlardır. Burada, SARS-CoV-2 PV’lerin COVID-19 aşılamasından sonra hastaların serumunun nötralize edici yeteneğini test etmek için nasıl kullanılabileceğini gösteren ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır.

Abstract

Psödotipli virüsler (PV’ler), ilgilenilen bir genin verilmesi için gen terapisinde daha iyi bilinen kullanımlarına ek olarak, konak-virüs etkileşimlerini incelemek ve serum örneklerinin nötralize edici yeteneğini test etmek için kullanılabilen moleküler araçlardır. PV’ler replikasyon kusurludur çünkü viral genom, PV’lere dahil edilmeyen farklı plazmitlere bölünmüştür. Bu güvenli ve çok yönlü sistem, biyogüvenlik seviye 2 laboratuvarlarında PV’lerin kullanılmasına izin verir. Burada, burada belirtildiği gibi üç plazmide dayalı lentiviral PV’ler üretmek için genel bir metodoloji sunuyoruz: (1) enfeksiyonu izlemek için gereken raportör geni taşıyan omurga plazmidi; (2) PV’leri üretmek için gereken tüm yapısal proteinler için genleri taşıyan ambalaj plazmidi; (3) virüs tropizmini belirleyen ve konakçı hücreye viral girişe aracılık eden zarf yüzeyi glikoprotein ekspresyon plazmidi. Bu çalışmada, SARS-CoV-2 Spike, replikatif olmayan SARS-CoV-2 psödotipli lentivirüslerin üretimi için kullanılan zarf glikoproteinidir.

Kısaca, paketleme hücreleri (HEK293T) standart yöntemler kullanılarak üç farklı plazmit ile birlikte transfekte edildi. 48 saat sonra, PV’leri içeren süpernatan hasat edildi, filtrelendi ve -80 °C’de depolandı. SARS-CoV-2 PV’lerin enfektivitesi, enfeksiyondan 48 saat sonra bir hedef hücre hattında raportör genin (lusiferaz) ekspresyonu incelenerek test edildi. Bağıl lüminesans birimleri (RLU’lar) için değer ne kadar yüksek olursa, enfeksiyon/transdüksiyon oranı o kadar yüksek olur. Ayrıca, enfeksiyöz PV’ler, RLU yoğunluğundaki azalma olarak ölçülen, psödovirüslerin hedef hücrelere girişinin nötralizasyon sürecini incelemek için seri olarak seyreltilmiş serum örneklerine eklendi: yüksek nötralize edici aktiviteye karşılık gelen daha düşük değerler.

Introduction

Psödotipli virüsler (PV’ler), mikrobiyolojide konak-virüs ve patojen-patojen etkileşimlerini incelemek için kullanılan moleküler araçlardır 1,2,3,4. PV’ler, viral genomu koruyan viral çekirdek olan bir iç kısımdan ve bir dış kısımdan, tropizmi tanımlayan virüsün yüzeyindeki zarf glikoproteinlerinden oluşur5. Bir psödovirüs, yeni viral parçacıklar oluşturmak için tüm genetik bilgiyi içermediği için hedef hücrede replikasyon yetersizdir. Tuhaf özelliklerin bu kombinasyonu, PV’leri vahşi tip bir virüse güvenli bir alternatif haline getirir. Vahşi tip virüsler ise oldukça patojeniktir ve BSL 2 laboratuvarlarında analiz içinkullanılamaz 6.

PV’lerin enfektivitesi, genellikle bir floresan proteini (GFP, RFP, YFP) veya kemilüminesan ürünler (lusiferaz) üreten bir enzimi kodlayan bir raportör gen tarafından izlenebilir. Bu, PV üretimi için kullanılan plazmitlerden birinde bulunur ve psödovirüs7’nin genomuna dahil edilir.

Şu anda HIV-1 genomuna dayanan lentiviral türevli parçacıklar da dahil olmak üzere çeşitli PV çekirdek türleri mevcuttur. HIV-1 tabanlı PV’lerin diğer platformlara göre en büyük avantajı, hedef hücre genomundaki içsel entegrasyon süreçleridir8. HIV-1 oldukça bulaşıcı bir virüs olmasına ve AIDS’e neden olmasına rağmen, bu lentiviral vektörlerin yıllar boyunca kapsamlı optimizasyon adımları nedeniyle kullanımı güvenlidir. Viral genlerin transdüksiyon yeteneklerini etkilemeden tükendiği 2nd nesil lentiviral vektörün piyasaya sürülmesiyle optimal güvenlik koşulları sağlandı9. 3. ve 4. nesiller, viral genomun ayrı plazmitlere daha fazla bölünmesiyle lentiviral vektör işlemenin artan güvenliğine katkıda bulundu10,11. En yeni nesil PV’ler genellikle gen terapisi için lentiviral vektörler üretmek için kullanılır.

PV’ler, hem üretim hem de enfeksiyon aşamalarında virüsler ve konakçı hücreler arasındaki etkileşimleri incelemek için kullanılabilir. PV’ler özellikle psödovirüs nötralizasyon deneylerinde (PVNA) kullanılır. PVNA’lar, PV’nin zarfı12,13 üzerindeki viral glikoproteini hedefleyerek serum veya plazmanın nötralizasyon potansiyelini değerlendirmek için geniş çapta doğrulanmıştır. İnhibitör konsantrasyon 50 (IC50) olarak ifade edilen nötralizasyon aktivitesi, viral partikül girişinin %50’sini bloke eden serum/plazmanınseyreltilmesi olarak tanımlanır 14. Bu protokolde, bir rapel aşı dozu almadan önce ve sonra toplanan serumlarda Şiddetli Akut Solunum Sendromu – Koronavirüs 2’ye (SARS-CoV-2) karşı antikor aktivitesini test etmek için bir PVNA’nın kurulumunu tanımladık.

Protocol

Bu protokol, Verona Üniversitesi Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır ve yönergelerini takip etmektedir (onay protokolü numarası 1538). Çalışmaya katılan insan deneklerden bilgilendirilmiş yazılı onam alınmıştır. Anti-SARS-CoV-2 aşıları alma sürecinde olan sağlık çalışanı (HCW) gönüllülerinden tam kan örnekleri toplandı. Bu örnekler, serum15’in daha sonra izolasyonu için antikoagülan içeren plastik tüplerde toplandı. Aşağıdak…

Representative Results

Bu protokol, anti-COVID-19 aşısı17 alan deneklerin serum/plazmasının nötralizasyon aktivitesini analiz etmek için SARS-CoV-2 PV’lerin üretimini ve bu PV’lerin aşağı akış uygulamasını açıklar. Ayrıca, bu protokol, nötralize edici yanıtın evrimini test etmek için her bir SARS-CoV-2 endişe varyantının (VOC) sözde tiplerini üretmek için uygulanabilir. COVID-19 aşılamasından sonra humoral immün yanıtın incelenmesini kolaylaştıran bu protokole rağmen, farklı serumla…

Discussion

Vahşi tip bir virüs kullanmak gerçek enfeksiyonu simüle etse de, lentiviral PV’ler, patojenik virüslerle çalışmak için gerekli katı güvenlik gereksinimleri olmadan viral giriş ve enfeksiyonla ilişkili mekanizmaları incelemek için daha güvenli bir seçenektir 4,20,21. PV’ler, çalışmanın amacı olan patojenik bir virüsün yüzey zarfı glikoproteini ile çevrili replikasyon kusurlu bir viral çekirdekten oluş…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Sağlık çalışanları gönüllülerinin katkılarını kabul ediyoruz. Bu proje, Mükemmellik Departmanı 2023/2027, MUR, İtalya tarafından desteklenmiştir. AR ve DZ, PRIN2022 (AB fonları; Yeni NesilEU)

Materials

0.45 μm filter SARSTEDT 83 1826
6-well plate SARSTEDT 83 3920
96-well plate SARSTEDT 8,33,924
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units Merck 10403892
Black Opaque 96-well Microplate Perkin Elmer 60005270
Dulbecco's Modified Eagle Medium  SIGMA-ALDRICH D6546 – 500ML
Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS 1x) AUROGENE AU-L0615-500
Foetal Bovine Serum AUROGENE AU-S1810-500
Graphpad Prism version 7 graphpad dotmatics NA In the manuscript, we replace the commercial name with 'data analysis program'
HEK293T cells ATCC CRL-3216
HEK293T/ACE2 cells ATCC CRL-3216 HEK293T has been transduced to overexpress ACE2 with a lentiviral vector.
L-glutamine  AUROGENE AU-X0550-100
Luminometer – Victor3 Perkin Elmer HH35000500 In the manuscript, we replace the commercial name with  'luminometer' 
Opti-MEM Thermo Fisher Scientific 11058021 In the manuscript, we replace the commercial name with 'reduced serum medium' 
p8.91 packaging plasmid Di Genova et al., 2021 A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.)
pCSFLW reporter plasmid Di Genova et al., 2021 A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.)
Penicillin/streptomycin AUROGENE AU-L0022-100
Polyethylenimine, branched (PEI) (25 kDa) SIGMA-ALDRICH 408727
RRL.sin.cPPT.SFFV/Ace2.IRES-puro.WPRE (MT126) Addgene 145839 This plasmid was used to generate HEK293Tcells/ACE2
SARS-CoV-2 Spike expressing plasmid Addgene pGBW-m4137382
steadylite plus Reporter Gene Assay System Perkin Elmer 6066759 In the manuscript, we replaced the commercial name with 'luciferase reading reagent'
Trypsin EDTA 1x AUROGENE AU-L0949-100
DOWNLOAD MATERIALS LIST

参考文献

  1. Ozaki, D. A., et al. International technology transfer of a GCLP-compliant HIV-1 neutralizing antibody assay for human clinical trials. Plos One. 7 (1), e30963 (2012).
  2. Pouget, M., et al. Generation of liposomes to study the effect of Mycobacterium tuberculosis lipids on HIV-1 cis- and trans-infections. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1945 (2021).
  3. McKay, L. G. A., et al. The HCV envelope glycoprotein down-modulates NF-κB signalling and associates with stimulation of the host endoplasmic reticulum stress pathway. Frontiers in Immunology. 13, 831695 (2022).
  4. Xiang, Q., Li, L., Wu, J., Tian, M., Fu, Y. Application of pseudovirus system in the development of vaccine, antiviral-drugs, and neutralizing antibodies. Microbiological Research. 258, 126993 (2022).
  5. Li, Q., Liu, Q., Huang, W., Li, X., Wang, Y. Current status on the development of pseudoviruses for enveloped viruses. Reviews in Medical Virology. 28, e1963 (2018).
  6. D’Apice, L., et al. Comparative analysis of the neutralizing activity against SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1 strain and variants of concern: Performance evaluation of a pseudovirus-based neutralization assay. Frontiers in Immunology. 13, 981693 (2022).
  7. Falzarano, D., Groseth, A., Hoenen, T. Development and application of reporter-expressing mononegaviruses: current challenges and perspectives. Antiviral Research. 103, 78-87 (2014).
  8. Gutierrez-Guerrero, A., Cosset, F. -. L., Verhoeyen, E. Lentiviral vector pseudotypes: Precious tools to improve gene modification of hematopoietic cells for research and gene therapy. Viruses. 12, 1016 (2020).
  9. Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo. Nature Biotechnology. 15 (9), 871-875 (1997).
  10. Dull, T. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. Journal of Virology. 72 (11), 8463-8471 (1998).
  11. Berkhout, B. A Fourth generation lentiviral Vector: Simplifying genomic gymnastics. Molecular Therapy. 25 (8), 1741-1743 (2017).
  12. Wu, X. Development and evaluation of a pseudovirus-luciferase assay for rapid and quantitative detection of neutralizing antibodies against Enterovirus 71. Plos One. 8 (6), e64116 (2013).
  13. Ferrara, F., et al. Development of lentiviral vectors pseudotyped with Influenza B hemagglutinins: application in vaccine immunogenicity, mAb potency, and sero-surveillance studies. Frontiers in Immunology. 12, 661379 (2021).
  14. Hu, J., et al. Development of cell-based pseudovirus entry assay to identify potential viral entry inhibitors and neutralizing antibodies against SARS-CoV-2. Genes & Diseases. 7 (4), 551-557 (2020).
  15. Dalle Carbonare, L., et al. Serology study after BTN162b2 vaccination in participants previously infected with SARS-CoV-2 in two different waves versus naïve. Communications Medicine. 1 (1), 38 (2021).
  16. Di Genova, C., et al. Production, titration, neutralisation, storage and lyophilisation of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) lentiviral pseudotypes. Bio-protocol. 11 (21), e4236 (2021).
  17. Chmielewska, A. M., Czarnota, A., Bieńkowska-Szewczyk, K., Grzyb, K. Immune response against SARS-CoV-2 variants: The role of neutralization assays. NPJ Vaccines. 6 (1), 1-8 (2021).
  18. Chen, Q., et al. Development and optimization of a sensitive pseudovirus-based assay for HIV-1 neutralizing antibodies detection using A3R5 cells. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (1), 199-208 (2018).
  19. Gauger, P. C., Vincent, A. L. Serum virus neutralization assay for detection and quantitation of serum neutralizing antibodies to influenza A virus in swine. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 2123, 321-333 (2020).
  20. Miglietta, R., Pastori, C., Venuti, A., Ochsenbauer, C., Lopalco, L. Synergy in monoclonal antibody neutralization of HIV-1 pseudoviruses and infectious molecular clones. Journal of Translational Medicine. 12 (1), 346 (2014).
  21. Chen, M., Zhang, X. -. E. Construction and applications of SARS-CoV-2 pseudoviruses: A mini review. International Journal of Biological Sciences. 17 (6), 1574-1580 (2021).
  22. Zipeto, D., et al. Induction of human immunodeficiency virus neutralizing antibodies using fusion complexes. Microbes and Infection. 8 (6), 1424-1433 (2006).
  23. WHO Coronavirus (COVID-19) Dashboard. Available from: https://covid19.who.int (2022)
  24. Zhou, P. A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin. Nature. 579 (7798), 270-273 (2020).
  25. Chen, X., Huang, H., Ju, J., Sun, R., Zhang, J. Impact of vaccination on the COVID-19 pandemic in U.S. states. Scientific Reports. 12 (1), 1554 (2022).
  26. Stefani, C., Fantoni, T., Bissoli, M., Thomas, J., Ruggiero, A. HIV and SARS-CoV-2 Co-Infection: From Population Study Evidence to In Vitro Studies. Life. 12 (12), 2089 (2022).
  27. Watson, O. J., et al. Global impact of the first year of COVID-19 vaccination: a mathematical modelling study. The Lancet Infectious Diseases. 22 (9), 1293-1302 (2022).
  28. Cantoni, D. Analysis of antibody neutralisation activity against SARS-CoV-2 variants and seasonal human coronaviruses NL63, HKU1, and 229E induced by three different COVID-19 vaccine olatforms. Vaccines. 11 (1), 58 (2023).
  29. Siracusano, G., et al. Different decay of antibody response and VOC sensitivity in naïve and previously infected subjects at 15 weeks following vaccination with BNT162b2. Journal of Translational Medicine. 20 (1), 22 (2022).
  30. Ruggiero, A. SARS-CoV-2 vaccination elicits unconventional IgM specific responses in naïve and previously COVID-19-infected individuals. eBioMedicine. 77, (2022).
  31. Piubelli, C. Subjects who developed SARS-CoV-2 specific IgM after vaccination show a longer humoral immunity and a lower frequency of infection. eBioMedicine. 89, 104471 (2023).
  32. Zhang, G. F. Infectivity of pseudotyped SARS-CoV-2 variants of concern in different human cell types and inhibitory effects of recombinant spike protein and entry-related cellular factors. Journal of Medical Virology. 95 (1), e28437 (2023).
  33. da Costa, K. A. S. Influenza A (N1-N9) and Influenza B (B/Victoria and B/Yamagata) neuraminidase pseudotypes as tools for pandemic preparedness and improved influenza vaccine design. Vaccines. 10 (9), 1520 (2022).
  34. Condor Capcha, J. M. Generation of SARS-CoV-2 spike pseudotyped virus for viral entry and neutralization assays: a 1-week protocol. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 7, 618651 (2021).
  35. Diomede, L., et al. Doxycycline inhibition of a pseudotyped virus transduction does not translate to inhibition of SARS-CoV-2 infectivity. Viruses. 13 (9), 1745 (2021).

タグ

Pseudotyped VirusesSARS-CoV-2Neutralization AssayMolecular ToolHost-virus InteractionsGene TherapyLentiviralPackaging CellsReporter GeneInfectivityRelative Luminescence Units

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
記事を引用
Fantoni, T., Bissoli, M., Stefani, C., Voi, M., Dabija, A., Casula, R., Minafra, D. L., da Fonseca Palmeira, J., Argañaraz, E. R., Mayora-Neto, M., Temperton, N. J., Zipeto, D., Ruggiero, A. Pseudotyped Viruses As a Molecular Tool to Monitor Humoral Immune Responses Against SARS-CoV-2 Via Neutralization Assay. J. Vis. Exp. (201), e65658, doi:10.3791/65658 (2023).
引用ダウンロード
転載と許可

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image