Virus pseudotypés en tant qu’outil moléculaire pour surveiller les réponses immunitaires humorales contre le SRAS-CoV-2 via un test de neutralisation
概要
Les virus pseudotypés (PV) sont des virions défectueux de réplication qui sont utilisés pour étudier les interactions hôte-virus dans des conditions plus sûres que la manipulation de virus authentiques. Nous présentons ici un protocole détaillé qui montre comment les PV du SRAS-CoV-2 peuvent être utilisés pour tester la capacité de neutralisation du sérum des patients après la vaccination contre la COVID-19.
Abstract
Les virus pseudotypés (PV) sont des outils moléculaires qui peuvent être utilisés pour étudier les interactions hôte-virus et pour tester la capacité neutralisante d’échantillons de sérum, en plus de leur utilisation plus connue en thérapie génique pour l’administration d’un gène d’intérêt. Les PV sont défectueux dans la réplication car le génome viral est divisé en différents plasmides qui ne sont pas incorporés dans les PV. Ce système sûr et polyvalent permet l’utilisation de PV dans des laboratoires de niveau de biosécurité 2. Nous présentons ici une méthodologie générale pour produire des PV lentiviraux à partir de trois plasmides mentionnés ici : (1) le plasmide de squelette portant le gène rapporteur nécessaire au suivi de l’infection ; (2) le plasmide d’emballage portant les gènes de toutes les protéines structurelles nécessaires à la génération des PV ; (3) le plasmide d’expression de la glycoprotéine de surface de l’enveloppe qui détermine le tropisme du virus et intervient dans l’entrée virale dans la cellule hôte. Dans ce travail, la pointe du SRAS-CoV-2 est la glycoprotéine d’enveloppe utilisée pour la production de lentivirus pseudotypés non réplicatifs du SRAS-CoV-2.
Brièvement, les cellules d’emballage (HEK293T) ont été co-transfectées avec les trois plasmides différents à l’aide de méthodes standard. Après 48 h, le surnageant contenant les PV a été récolté, filtré et stocké à -80 °C. L’infectiosité des PV du SRAS-CoV-2 a été testée en étudiant l’expression du gène rapporteur (luciférase) dans une lignée cellulaire cible 48 h après l’infection. Plus la valeur des unités de luminescence relative (RLU) est élevée, plus le taux d’infection/transduction est élevé. De plus, les PV infectieux ont été ajoutés aux échantillons de sérum dilués en série pour étudier le processus de neutralisation de l’entrée des pseudovirus dans les cellules cibles, mesuré par la réduction de l’intensité du RLU : des valeurs inférieures correspondant à une activité neutralisante élevée.
Introduction
Les virus pseudotypés (PV) sont des outils moléculaires utilisés en microbiologie pour étudier les interactions hôte-virus et pathogène-pathogène 1,2,3,4. Les PV sont constitués d’une partie interne, le noyau viral qui protège le génome viral, et d’une partie externe, les glycoprotéines d’enveloppe à la surface du virus qui définissent le tropisme5. Un pseudovirus est incompétent en matière de réplication dans la cellule cible car il ne contient pas toute l’information génétique nécessaire pour générer de nouvelles particules virales. Cette combinaison de caractéristiques particulières fait des PV une alternative sûre à un virus de type sauvage. Les virus de type sauvage, en revanche, sont hautement pathogènes et ne peuvent pas être utilisés dans les laboratoires BSL 2 pour l’analyse6.
L’infectiosité des PV peut être surveillée par un gène rapporteur, généralement codant pour une protéine fluorescente (GFP, RFP, YFP) ou une enzyme qui produit des produits chimiluminescents (luciférase). Celui-ci est contenu dans l’un des plasmides utilisés pour la production de PV et incorporé dans le génome du pseudovirus7.
Il existe actuellement plusieurs types de cœurs photovoltaïques, notamment des particules dérivées de lentiviraux basées sur le génome du VIH-1. Le grand avantage des PV à base de VIH-1 par rapport aux autres plateformes est leur processus d’intégration intrinsèque dans le génome de la cellule cible8. Bien que le VIH-1 soit un virus très contagieux et qu’il soit l’agent causal du sida, ces vecteurs lentiviraux peuvent être utilisés en toute sécurité en raison des nombreuses étapes d’optimisation au fil des ans. Des conditions de sécurité optimales ont été obtenues avec l’introduction de vecteurs lentiviraux de 2e génération, dans lesquels les gènes viraux ont été appauvris sans influencer les capacités de transduction9. Les 3eet 4egénérations ont contribué à accroître la sécurité de la manipulation des vecteurs lentiviraux avec la division du génome viral en plasmides distincts10,11. Les dernières générations de PV sont généralement utilisées pour produire des vecteurs lentiviraux pour la thérapie génique.
Les PV peuvent être utilisés pour étudier les interactions entre les virus et les cellules hôtes, tant pendant les phases de production que d’infection. Les PV sont particulièrement utilisés dans les essais de neutralisation des pseudovirus (PVNA). Les PVNA sont largement validés pour évaluer le potentiel de neutralisation du sérum ou du plasma en ciblant la glycoprotéine virale sur l’enveloppe du PV12,13. L’activité de neutralisation, exprimée par la concentration inhibitrice 50 (CI50), est définie comme la dilution du sérum/plasma qui bloque 50 % de l’entrée des particules virales14. Dans ce protocole, nous avons décrit la mise en place d’un PVNA pour tester l’activité des anticorps contre le syndrome respiratoire aigu sévère – Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) dans des sérums prélevés avant et après avoir reçu une dose de rappel du vaccin.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bien que l’utilisation d’un virus de type sauvage simule l’infection réelle, les PV lentiviraux sont une option plus sûre pour étudier les mécanismes associés à l’entrée virale et à l’infection sans les exigences de sécurité strictes nécessaires pour travailler avec des virus pathogènes 4,20,21. Les PV sont composés d’un noyau viral défectueux en réplication entouré de la glycoprotéine d’enveloppe …
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous reconnaissons la contribution des travailleurs de la santé bénévoles. Ce projet a été soutenu par le Département d’Excellence 2023/2027, MUR, Italie. L’AR et la DZ ont été soutenues par PRIN2022 (financements de l’UE ; NextGenerationEU)
Materials
| 0.45 μm filter | SARSTEDT | 83 1826 | |
| 6-well plate | SARSTEDT | 83 3920 | |
| 96-well plate | SARSTEDT | 8,33,924 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Merck | 10403892 | |
| Black Opaque 96-well Microplate | Perkin Elmer | 60005270 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | SIGMA-ALDRICH | D6546 – 500ML | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS 1x) | AUROGENE | AU-L0615-500 | |
| Foetal Bovine Serum | AUROGENE | AU-S1810-500 | |
| Graphpad Prism version 7 | graphpad dotmatics | NA | In the manuscript, we replace the commercial name with 'data analysis program' |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| HEK293T/ACE2 cells | ATCC | CRL-3216 | HEK293T has been transduced to overexpress ACE2 with a lentiviral vector. |
| L-glutamine | AUROGENE | AU-X0550-100 | |
| Luminometer – Victor3 | Perkin Elmer | HH35000500 | In the manuscript, we replace the commercial name with 'luminometer' |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | In the manuscript, we replace the commercial name with 'reduced serum medium' |
| p8.91 packaging plasmid | Di Genova et al., 2021 | A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.) | |
| pCSFLW reporter plasmid | Di Genova et al., 2021 | A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.) | |
| Penicillin/streptomycin | AUROGENE | AU-L0022-100 | |
| Polyethylenimine, branched (PEI) (25 kDa) | SIGMA-ALDRICH | 408727 | |
| RRL.sin.cPPT.SFFV/Ace2.IRES-puro.WPRE (MT126) | Addgene | 145839 | This plasmid was used to generate HEK293Tcells/ACE2 |
| SARS-CoV-2 Spike expressing plasmid | Addgene | pGBW-m4137382 | |
| steadylite plus Reporter Gene Assay System | Perkin Elmer | 6066759 | In the manuscript, we replaced the commercial name with 'luciferase reading reagent' |
| Trypsin EDTA 1x | AUROGENE | AU-L0949-100 |
参考文献
- Ozaki, D. A., et al. International technology transfer of a GCLP-compliant HIV-1 neutralizing antibody assay for human clinical trials. Plos One. 7 (1), e30963 (2012).
- Pouget, M., et al. Generation of liposomes to study the effect of Mycobacterium tuberculosis lipids on HIV-1 cis- and trans-infections. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1945 (2021).
- McKay, L. G. A., et al. The HCV envelope glycoprotein down-modulates NF-κB signalling and associates with stimulation of the host endoplasmic reticulum stress pathway. Frontiers in Immunology. 13, 831695 (2022).
- Xiang, Q., Li, L., Wu, J., Tian, M., Fu, Y. Application of pseudovirus system in the development of vaccine, antiviral-drugs, and neutralizing antibodies. Microbiological Research. 258, 126993 (2022).
- Li, Q., Liu, Q., Huang, W., Li, X., Wang, Y. Current status on the development of pseudoviruses for enveloped viruses. Reviews in Medical Virology. 28, e1963 (2018).
- D’Apice, L., et al. Comparative analysis of the neutralizing activity against SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1 strain and variants of concern: Performance evaluation of a pseudovirus-based neutralization assay. Frontiers in Immunology. 13, 981693 (2022).
- Falzarano, D., Groseth, A., Hoenen, T. Development and application of reporter-expressing mononegaviruses: current challenges and perspectives. Antiviral Research. 103, 78-87 (2014).
- Gutierrez-Guerrero, A., Cosset, F. -. L., Verhoeyen, E. Lentiviral vector pseudotypes: Precious tools to improve gene modification of hematopoietic cells for research and gene therapy. Viruses. 12, 1016 (2020).
- Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo. Nature Biotechnology. 15 (9), 871-875 (1997).
- Dull, T. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. Journal of Virology. 72 (11), 8463-8471 (1998).
- Berkhout, B. A Fourth generation lentiviral Vector: Simplifying genomic gymnastics. Molecular Therapy. 25 (8), 1741-1743 (2017).
- Wu, X. Development and evaluation of a pseudovirus-luciferase assay for rapid and quantitative detection of neutralizing antibodies against Enterovirus 71. Plos One. 8 (6), e64116 (2013).
- Ferrara, F., et al. Development of lentiviral vectors pseudotyped with Influenza B hemagglutinins: application in vaccine immunogenicity, mAb potency, and sero-surveillance studies. Frontiers in Immunology. 12, 661379 (2021).
- Hu, J., et al. Development of cell-based pseudovirus entry assay to identify potential viral entry inhibitors and neutralizing antibodies against SARS-CoV-2. Genes & Diseases. 7 (4), 551-557 (2020).
- Dalle Carbonare, L., et al. Serology study after BTN162b2 vaccination in participants previously infected with SARS-CoV-2 in two different waves versus naïve. Communications Medicine. 1 (1), 38 (2021).
- Di Genova, C., et al. Production, titration, neutralisation, storage and lyophilisation of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) lentiviral pseudotypes. Bio-protocol. 11 (21), e4236 (2021).
- Chmielewska, A. M., Czarnota, A., Bieńkowska-Szewczyk, K., Grzyb, K. Immune response against SARS-CoV-2 variants: The role of neutralization assays. NPJ Vaccines. 6 (1), 1-8 (2021).
- Chen, Q., et al. Development and optimization of a sensitive pseudovirus-based assay for HIV-1 neutralizing antibodies detection using A3R5 cells. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (1), 199-208 (2018).
- Gauger, P. C., Vincent, A. L. Serum virus neutralization assay for detection and quantitation of serum neutralizing antibodies to influenza A virus in swine. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 2123, 321-333 (2020).
- Miglietta, R., Pastori, C., Venuti, A., Ochsenbauer, C., Lopalco, L. Synergy in monoclonal antibody neutralization of HIV-1 pseudoviruses and infectious molecular clones. Journal of Translational Medicine. 12 (1), 346 (2014).
- Chen, M., Zhang, X. -. E. Construction and applications of SARS-CoV-2 pseudoviruses: A mini review. International Journal of Biological Sciences. 17 (6), 1574-1580 (2021).
- Zipeto, D., et al. Induction of human immunodeficiency virus neutralizing antibodies using fusion complexes. Microbes and Infection. 8 (6), 1424-1433 (2006).
- WHO Coronavirus (COVID-19) Dashboard. Available from: https://covid19.who.int (2022)
- Zhou, P. A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin. Nature. 579 (7798), 270-273 (2020).
- Chen, X., Huang, H., Ju, J., Sun, R., Zhang, J. Impact of vaccination on the COVID-19 pandemic in U.S. states. Scientific Reports. 12 (1), 1554 (2022).
- Stefani, C., Fantoni, T., Bissoli, M., Thomas, J., Ruggiero, A. HIV and SARS-CoV-2 Co-Infection: From Population Study Evidence to In Vitro Studies. Life. 12 (12), 2089 (2022).
- Watson, O. J., et al. Global impact of the first year of COVID-19 vaccination: a mathematical modelling study. The Lancet Infectious Diseases. 22 (9), 1293-1302 (2022).
- Cantoni, D. Analysis of antibody neutralisation activity against SARS-CoV-2 variants and seasonal human coronaviruses NL63, HKU1, and 229E induced by three different COVID-19 vaccine olatforms. Vaccines. 11 (1), 58 (2023).
- Siracusano, G., et al. Different decay of antibody response and VOC sensitivity in naïve and previously infected subjects at 15 weeks following vaccination with BNT162b2. Journal of Translational Medicine. 20 (1), 22 (2022).
- Ruggiero, A. SARS-CoV-2 vaccination elicits unconventional IgM specific responses in naïve and previously COVID-19-infected individuals. eBioMedicine. 77, (2022).
- Piubelli, C. Subjects who developed SARS-CoV-2 specific IgM after vaccination show a longer humoral immunity and a lower frequency of infection. eBioMedicine. 89, 104471 (2023).
- Zhang, G. F. Infectivity of pseudotyped SARS-CoV-2 variants of concern in different human cell types and inhibitory effects of recombinant spike protein and entry-related cellular factors. Journal of Medical Virology. 95 (1), e28437 (2023).
- da Costa, K. A. S. Influenza A (N1-N9) and Influenza B (B/Victoria and B/Yamagata) neuraminidase pseudotypes as tools for pandemic preparedness and improved influenza vaccine design. Vaccines. 10 (9), 1520 (2022).
- Condor Capcha, J. M. Generation of SARS-CoV-2 spike pseudotyped virus for viral entry and neutralization assays: a 1-week protocol. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 7, 618651 (2021).
- Diomede, L., et al. Doxycycline inhibition of a pseudotyped virus transduction does not translate to inhibition of SARS-CoV-2 infectivity. Viruses. 13 (9), 1745 (2021).
