利用显微计算机断层扫描血管造影成功对小鼠进行原位肝移植

雄性C57BL / 6J小鼠（30g体重）在无病原体条件下饲养在全国儿童医院动物设施中。所有程序均根据 NIH 和国家研究委员会的《实验动物人道护理和使用指南》并经全国儿童医院机构动物护理和使用委员会（IACUC 协议 AR17-00045）批准，以人道方式执行。有关本协议中使用的所有材料、仪器和设备的详细信息，请参阅 材料表 。 1. 移植手术的初始设置 设置手术器械。设置手术监测设备（即心率监测设备、脉搏血氧、模块化监测系统）和麻醉机。 如果可用，将手术加热板打开至42°C。 确保打开通风和麻醉机以加热异氟烷蒸发器。用 30 mL 液体异氟醚填充麻醉储液器，并确保呼吸机连接到氧气。注意：在本协议中，我们不给动物插管;仅使用鼻锥进行氧合。 记录受体和供体小鼠的体重。 打开高倍手术显微镜，根据外科医生的喜好调整高度和焦点。确保打开剩余的手术设备（即电烙设备）。 准备和布置手术器械，以及 10-0 尼龙的手术扎带（图 2）。注意：所有手术器械均在121°C下高压灭菌30分钟。此外，手术器械的不同配置可能同样有效。 为门静脉 （PV） 和胆总管 （CBD） 支架准备袖带（图 3）。将血管导管和PE10放在高倍显微镜下的无菌表面上。使用 #11 手术刀片，切割血管导管以形成一个 1.5 毫米长的袖带，袖带主体顶部有一个约 0.75 毫米的标签;将聚乙烯管 （PE10） 切割成 2.5 毫米的长度。将袖带和支架存放在无菌盐水中，直到准备好使用。注意：该移植模型利用 20 G 血管导管制作用于 PV 重建的袖带，以及用于重建 CBD 的聚乙烯管 10 （PE10）。所有其他吻合口都是手工缝制的。 准备解决方案。准备肝素注射液，该注射液将在 0.5 mL 组氨酸 – 色氨酸 – 酮戊二酸 （HTK） 溶液中以 100 U 递送。将生理盐水、肝素盐水、PBS 和 HTK 保存溶液储存在冰上。 2. 供体小鼠采购 通过将供体小鼠置于异氟烷吸入室中来诱导供体小鼠的麻醉。确保异氟烷浓度约为 2.5%，氧流量为 2 mL/min。等待 5 分钟，以形成麻醉手术平面。为确保适当的麻醉水平，脚趾捏住鼠标以引起反应;缺乏反应表明已达到适当的麻醉水平。 使用电子剪子剃掉鼠标的腹部，然后将鼠标置于加热板上的仰卧位。用聚维酮碘清洁腹部，然后用70%乙醇清洁。将眼药膏放在小鼠的眼睛下方以防止干燥。 将小鼠置于高倍显微镜下，并使用2%浓度的异氟醚吸入2%浓度的氧气流量保持小鼠处于麻醉状态。 用一把剪刀（外科医生首选）从剑突到耻骨联合进行中线剖腹手术。接下来，进行额外的横向切口，以创建低于肋骨的“十字状”图案。使用蚊子止血钳，缩回剑突以充分暴露腹部内容物。注意：镊子可以根据外科医生的喜好固定。 将肠子内脏取出，然后用湿纱布海绵将其放在腹腔左侧。通过取下所有韧带附着物来动员肝脏。 暴露适当的肝动脉 （pHA）。使用曲线镊子对血管进行骨架化，并用 10-0 尼龙缝合线结扎。 使用尖锐和钝性解剖的组合解剖CBD的整个长度。尽可能靠近胰腺上缘进行导管切开术（足够大，适合CBD支架），以提供足够的长度以备将来使用（距肝脏下缘~1厘米）。用细镊子将胆管支架插入 CBD，并用 10-0 尼龙缝合线固定。使用10-0尼龙缝合线结扎CBD的远端（图4）。 使用湿纱布海绵将右肝叶缩回剑突并暴露 IVC。将肝下IVC（IHIVC）从腹膜后移开，并使用手持烧灼装置烧灼右肾上腺静脉（见 材料表）。 解剖右肾动脉和静脉，分别用7-0和10-0尼龙结扎。切开右肾静脉和动脉以及剩余的韧带附件。最后，切除右肾。注意：这样做是为了在最终切割 IHIVC 时获得更好的曝光。 用 30 G 针头通过 PV 注入 0.5 mL 冷 HTK 和 100 U 肝素溶液。等待 1 分钟，让肝素系统分布。切开脾静脉和肠系膜上静脉上方的门静脉。 用30G针头在IHIVC中缓慢注射含有肝素的冷HTK保存溶液，以灌注供体肝脏。一旦来自 PV 的流体变清澈，就停止注入溶液。注射完成后，在右肾静脉上方的 IHIVC 上放置一个微型夹具，并在夹具下方切割。完成此步骤后，关闭呼吸机并停止使用异氟烷，因为动物刚刚被安乐死。 将CBD远端切到先前放置在步骤2.7中的支架上。此外，识别囊性导管，并用 10-0 尼龙缝合线结扎导管。接下来，用一把镊子抓住胆囊的圆顶，并使用尖锐和钝性解剖的组合从胆囊窝中解剖出来。一旦胆囊充分活动，使用一把弹簧剪刀，通过在先前放置的缝合线上方切割囊管来完成胆囊切除术。 肝脏下缩回以暴露肝上IVC（SHIVC）。切开 SHIVC，特别注意为受体动物的吻合提供足够的长度。 解剖肝脏的游离附加韧带附着物，并 离 体输送供体肝脏，并将器官放入装有冷盐水的容器中。 3.同种异体肝移植的背台制备 将冰块放入绝缘容器中，然后将培养皿放在冰床上。用冷盐水填充培养皿。将同种异体肝移植物放入培养皿中，使内脏表面暴露。 将 PV 穿过先前选择的袖带，并穿过静脉，使内皮内表面暴露出来。用 10-0 尼龙缝合线固定袖带。确保缝合线位于袖带的凹槽内以获得最佳效果（图 5）。 调整同种异体肝移植以暴露SHIVC并放置两个8-0尼龙分别在 3′ 和 9 点钟方向缝合，用于最终吻合受体动物。再次调整肝脏同种异体移植物以暴露IHIVC并放置两个8-0尼龙分别在 3′ 和 9 点钟方向缝合，用于最终吻合受体动物。 4. 收件人操作 注意：由于这是无菌手术，请使用手套和适当的个人防护设备并服用抗生素。手术时皮下注射 0.1 mg/kg 丁丙诺啡作为术前镇痛剂。 像在供体操作中一样暴露 pHA;仅使用中线剖腹手术，而不是先前描述的腹部切口。 动员肝脏并切断所有韧带附着物。此外，用 10-0 尼龙缝合线结扎左侧膈血管和食管旁血管。 将肝脏向下缩回，从腹膜后解剖出 SHIVC。接下来，将肝脏向上缩回并从腹膜后解剖 IHIVC。必要时使用与前面描述的相同的技术烧灼小桥静脉和腰静脉。 用手持烧灼术烧灼右肾上腺静脉，并暴露肝门。用 10-0 尼龙缝合线连接 pHA。接下来，从PV中解剖出CBD，并在靠近CBD分叉处的7-0缝合线中连接CBD，为CBD吻合提供足够的长度。 利用微夹住肝下 IVC，并用 7-0 缝合线暂时结扎 PV。开始肝脏期。停止吸入异氟烷。注意：夹紧门静脉和IVC后，肝静脉回流在肝脏阶段完全阻塞。吸入麻醉剂异氟醚由肝脏代谢;因此，它的吸入会暂时停止，因为蓄积会导致心肺衰竭。 通过天然肝脏的PV，用30G针头注射0.5mL肝素盐水以冲洗器官。 在 SHIVC 和 IHIVC 上放置微血管夹，尽可能靠近和远端，以留出足够的吻合长度。切断天然 SHIVC、IHIVC、PV（靠近先前放置的缝合线）和任何剩余的韧带附着物到接受者的天然肝脏，并在 体外输送天然肝脏。注意： IHIVC 夹应位于右肾静脉上方。 将供体同种异体移植物置于腹腔内，并缩回供体同种异体移植物的肺门以暴露 PV。使用 30 G 针头用 0.5 mL 肝素盐水冲洗供体和天然 PV，以对血管进行除气以避免空气栓塞。然后，将先前制作的供体 PV 袖带插入受体肝 PV 的管腔中，如有必要，放置固定缝合线以帮助吻合（8-0 缝合线）。用 7-0 缝合线固定吻合口（图 6）。 将电路板旋转 180°。用 10-0 尼龙缝合线与供体和天然 SHIVC 进行手工缝合吻合。完成后壁吻合后，用 0.5 mL 肝素盐水冲洗以去除空气以避免空气栓塞。上壁完全吻合（图7）。 先取下PV的结扎缝合线;然后，从 SHIVC 中取出血管夹以开始再灌注。结束肝脏期并重新开始异氟烷吸入。用 10-0 尼龙缝合线进行手工缝合，与 SHIVC 吻合术相同的方式重建 IHIVC。完成重建后，从天然和供体IHIVC中取出微夹以重新灌注（图8）。 通过在先前放置的缝合线附近的受体 CBD 上进行导管切开术来执行 CBD 吻合术。将供体CBD中的支架插入受体CBD腔，并用10-0缝合线固定吻合口（图9）。 用 1 mL 生理盐水冲洗腹腔;检查止血情况并烧灼任何剩余的出血血管。使用 6-0 缝合线将腹部切口分两层闭合。 将动物置于温暖的培养箱（42°C）中进行恢复，在动物恢复意识和足够的活动之前，不要让动物无人看管。术后皮下注射 0.1 mg/kg 丁丙诺啡，术后 48 小时每 8 至 12 小时继续给药一次。此外，手术后通过受体动物的水瓶给予卡洛芬（0.2 mL 溶解在 400 mL 水中）长达 7 天。观察受体动物4-5小时，一旦它完全康复，将其放回饲养地点，因为现在可以安全地与其他动物在一起。注意：止痛药和抗生素可以根据当地动物伦理委员会的建议进行管理。 5. 小鼠microCT血管造影成像 在观察小鼠预定的研究间隔后，准备小鼠使用microCT血管造影评估同种异体移植物的通畅性。 确保打开通风和麻醉机以加热异氟烷蒸发器。用 30 mL 液体异氟烷填充麻醉储液器，并确保呼吸机连接到氧气。打开microCT扫描仪，确保所有软件都正常运行。 启动microCT扫描仪系统上的采集软件。 在microCT单元的显示器上，单击 初始化系统 ，然后选择 CT扫描模式。 弹出床;安装鼠标床并锁定。 将加热板打开至 42 °C 作为恢复笼。 用 100 μL CT 造影剂填充 1 mL 注射器。连接一根 30 号针头，以便将来静脉注射造影剂。确保注射器中没有气泡。 将鼠标放入尾静脉约束系统中。一旦鼠标完全进入约束系统，关闭系统的门，让尾巴垂直下垂，然后用酒精溶液（70%乙醇）小心擦拭。注意：通过用戴手套的手握住动物的尾巴几分钟来加热动物的尾巴，可以增加尾静脉插管的成功率。 将尾巴朝向远端，并将两根手指（食指和中指）放在靠近计划注射部位的尾巴周围。将尾巴的远端（注射部位下方）放在拇指和无名指之间。 用两组手指轻轻施加压力，然后用较浅的深度将针头插入静脉，确保注射器和针头与尾部平行。在释放食指在近端尾部的压力的同时，静脉注射CT造影剂。避免用注射器抽吸，因为这会导致静脉塌陷。注意：如果针头在静脉中正确定位，则在注射过程中不应感到阻力。如果有阻力，请取出针头并将其重新插入原始注射部位上方。如果静脉插管在两次尝试后仍失败，请更换针头。 成功注射造影剂并取出针头后，使用无菌纱布轻轻按压注射部位以止血。 将小鼠转移到异氟烷吸入室中，并将浓度设置为2.5%，氧气流量为2mL / min，并等待3-4分钟。一旦建立了麻醉平面，将鼠标快速转移到microCT扫描仪床上，并将其置于扫描台上的俯卧位（图10）。 用适量的眼药膏覆盖动物的眼睛。将鼻锥适当地放在动物身上，并确保空气和异氟烷正确流过鼻锥。使用前面描述的相同麻醉参数（步骤5.12）。润滑并插入直肠温度探头，以在成像过程中连续监测动物的体温。 将呼吸器与鼠标接触。 使用胶带将心电图垫固定在左肢、右前肢和左后肢上。使用超声波凝胶改善心电图垫和皮肤之间的信号。 检查计算机软件上的心电图和呼吸信号，以确保在监视器上看到正确的 QRS 波群。为此，请选中“源设置”选项卡中的“逻辑导联”，然后选择提供最清晰 ECG 曲线的导联。注意： 逻辑导联对应于连接到右、左胸和小腿的三个心电图垫。每条导联代表一条心电图曲线。 将 增益 设置为适当的信号高度，通常 4 或 8 是好的。选择 双门控。在 “显示设置” 选项卡下，调整显示设置以获得清晰的信号视图：勾选 ECG 和 RESP 旁边的框，并将每个框设置为 500。在 “触发器设置 ”选项卡下，确认已选中 通道 A、通道 B 和 DualTrig 。 确保还设置了以下参数： 阈值：当信号低于此值时;将值设置为 2,500; 迟滞：确保信号越过迟滞，以创建一个软件触发点，在该点开始新的触发周期;将值设置为 300; 延迟：在发送触发器之前等待;将值设置为 100; 禁止：在此期间不能产生信号，设置值为 200。 确保 ECG 的阈值低于滞后值，高于显示屏上 sT 段的峰值。 将动物推进到扫描仪中，然后按 更新图像。获取动物的 X 射线侦察图像，为随后的 microCT 图像选择适当的视野和解剖扫描覆盖范围。 使用以下参数进行 microCT 血管造影图像采集： 放大倍率：超聚焦，扫描角度：全 （360） 度扫描，能量：单次扫描，扫描模式：门控，设置：默认（全 360° 旋转，X 射线管默认设置为 0.33 mA 和 55 kV，每步 0.750° 度，每步 1 次投影，1 x 1 像素合并和 40 毫秒曝光时间;双门控 意味着 心脏和呼吸门控）（图 11）。 扫描完成后，将动物转移到预热的恢复笼中。一旦动物完全康复，将其转移回其主笼子。 使用系统软件重建microCT图像。上传图像后，设置蓝色条，使其跨越感兴趣的解剖区域;预览切片以使体积更小，并尽可能限制在鼠标上（此阶段有助于减小重建图像的大小）。 打开感兴趣轮廓的体积以优化图像边界。选择 40 μm 体素尺寸、Hann 投影滤波器 和 高斯体积滤波器 （80 μm）。转到 高级 |基于图像的门控 ，将 触发窗口 和 相位 分别调整 为 0.5 和 0.6，选择 10 相 位进行 心脏门控，然后按下 体积重建 按钮。