概要

הדמיית סידן דו-פוטון של פעילות המוח הקדמי בדגי זברה בוגרים

Published: July 28, 2023
doi:

概要

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לביצוע הדמיית סידן של שני פוטונים במוח הקדמי הגבי של דגי זברה בוגרים.

Abstract

דגי זברה בוגרים (Danio rerio) מפגינים רפרטואר עשיר של התנהגויות לחקר תפקודים קוגניטיביים. יש להם גם מוח מיניאטורי שיכול לשמש למדידת פעילויות בין אזורי מוח באמצעות שיטות הדמיה אופטית. עם זאת, דיווחים על רישום פעילות מוחית בדגי זברה בוגרים היו נדירים. המחקר הנוכחי מתאר הליכים לביצוע הדמיית סידן של שני פוטונים במוח הקדמי הגבי של דגי זברה בוגרים. אנו מתמקדים בצעדים לריסון דגי זברה בוגרים מלהזיז את ראשם, מה שמספק יציבות המאפשרת הדמיה בלייזר של פעילות המוח. בעלי החיים המרוסנים לראש יכולים להזיז בחופשיות את חלקי גופם ולנשום ללא עזרים. מטרת ההליך היא לקצר את זמן ניתוח ריסון הראש, למזער את תנועת המוח ולמקסם את מספר תאי העצב שנרשמו. כאן מתוארת גם הגדרה להצגת סביבה חזותית אימרסיבית במהלך הדמיית סידן, שניתן להשתמש בה כדי לחקור קורלציות עצביות העומדות בבסיס התנהגויות המופעלות על ידי ראייה.

Introduction

הדמיית סידן פלואורסצנטי עם אינדיקטורים מקודדים גנטית או צבעים סינתטיים הייתה שיטה רבת עוצמה למדידת פעילות עצבית בבעלי חיים מתנהגים, כולל פרימטים לא אנושיים, מכרסמים, ציפורים וחרקים1. את פעילותם של מאות תאים, עד כ-800 מיקרומטר מתחת לפני השטח של המוח, ניתן למדוד בו זמנית באמצעות דימות רב-פוטוני 2,3. ניתן למדוד את פעילותם של סוגי תאים מסוימים גם על ידי ביטוי מדדי סידן באוכלוסיות נוירונים מוגדרות גנטית. יישום שיטת ההדמיה עבור מודלים קטנים של בעלי חוליות פותח אפשרויות חדשות בתחום החישוב העצבי על פני אזורי מוח.

דגי זברה הם מערכת מודל נפוצה במחקר מדעי המוח. דגי זברה זחלים בסביבות 6 ימים לאחר ההפריה שימשו להדמיית סידן בשל מוחם המיניאטורי וגופם השקוף4. דגי זברה צעירים (בני 3-4 שבועות) משמשים גם לחקר המנגנונים העצביים העומדים בבסיס מסלולים סנסומוטוריים 5,6. עם זאת, רמת הביצוע המקסימלית עבור התנהגויות מורכבות, כולל למידה אסוציאטיבית והתנהגויות חברתיות, מושגת בגיל מבוגר יותר 7,8. לפיכך, נדרש פרוטוקול אמין כדי לחקור תפקודים קוגניטיביים מרובים במוחם של דגי זברה בוגרים באמצעות שיטות הדמיה. בעוד שזחלי זברה ודגי זברה צעירים יכולים להיות מוטמעים באגרוז להדמיית in vivo, דגי זברה בוגרים בגיל חודשיים ומעלה סובלים מהיפוקסיה בתנאים כאלה והם חזקים מדי פיזית מכדי להיות מרוסנים על ידי אגרוז. לכן, נדרש הליך כירורגי כדי לייצב את המוח ולאפשר לבעל החיים לנשום בחופשיות דרך הזימים.

כאן, אנו מתארים פרוטוקול ריסון ראש הכולל עיצוב חדשני של מוט ראש יחיד. זמן הניתוח המופחת של 25 דקות מהיר פי שניים מהשיטההקודמת 9. אנו מתארים גם את העיצוב של תא ההקלטה (מיכל חצי משושה), שלב הראש ומנגנון נעילה מהירה לשילוב שני החלקים9. לבסוף, מתואר גם המערך להצגת גירוי חזותי סוחף לחקר פעילות והתנהגויות מוחיות המופעלות על ידי ראייה. באופן כללי, ההליכים המתוארים כאן יכולים לשמש לביצוע דימות סידן של שני פוטונים באוכלוסיות תאים מוגדרות גנטית בדג זברה בוגר מרוסן ראש, המאפשר לחקור פעילויות מוחיות במהלך פרדיגמות התנהגותיות שונות.

Protocol

כל ההליכים בבעלי חיים אושרו ובוצעו בהתאם להנחיות הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של האקדמיה סיניקה. פירוט כלי המחקר ניתן למצוא בטבלת החומרים. 1. הכנת תא הקלטה הכינו מכל חצי משושה, פלטת בסיס ובמת ראש (איור 1A; קבצים משלימים 1-3…

Representative Results

הפרוטוקול מורכב משני חלקים: ניתוח ריסון ראש והדמיית סידן בשני פוטונים של פעילות עצבית במוח הקדמי. הצלחת הניתוח מוגדרת על ידי הישרדות החיה ויציבות ריסון הראש. ניתן לשפר מאוד את שיעור ההישרדות על ידי זילוח תכוף של תמיסת TMS 0.01% דרך הפה במהלך הניתוח. דגים צריכים להתאושש מהרדמה ולנשום באופן פעיל…

Discussion

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול מפורט לריסון ראשם של דגי זברה בוגרים לצורך הדמיית סידן של שני פוטונים. ישנם שני שלבים קריטיים להשגת משענת ראש יציבה מספיק להדמיית סריקת לייזר. ראשית, מוט הראש צריך להיות מודבק לאתרי החיבור הספציפיים של הגולגולות. חלקים אחרים של הגולגולת הם לעתים קרובות דקים מכ?…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי המכון לביולוגיה מולקולרית, האקדמיה סיניקה והמועצה הלאומית למדע וטכנולוגיה, טייוואן. חנות המכונות במכון לפיזיקה, אקדמיה סיניקה סייעה לייצר חלקים שתוכננו בהתאמה אישית. אנו גם רוצים להודות לפ. ארגסט (מכון פרידריך מיישר למחקר ביו-רפואי, בזל, שוויץ) על תכנון מנגנון הנעילה המהירה של שלב הראש.

Materials

Acquisition card MBF Bioscience Vidrio vDAQ Microscope
Back-projection film Kimoto Diland screen – GSK present visual stimulus
Band-pass filter (510/80 nm) Chroma ET510/80m Microscope
Base plate for the semi-hexagonal tank custom made see supplemental files recording chamber
Camera filter (<875 nm) Edmund optics #86-106 Behavior recording
Camera filter (>700 nm) Edmund optics #43-949 Behavior recording
Camera lens Thorlabs MVL50M23 Behavior recording
Chameleon Vision-S Coherent Vision-S Laser
Circular plate for the head stage custom made see supplemental files recording chamber
Controller for piezo actuator Physik Instrumente  E-665. CR Microscope
Current amplifier Thorlabs TIA60 Microscope
Elitedent Q-6 Rolence Enterprise Q-6 Surgery: UV lamp
Emission Filter 510/80 nm Chroma ET510/80m Microscope
Head bar custom made see supplemental files recording chamber
Infrared light Thorlabs M810L3 Behavior recording
LED projector AAXA P2B LED Pico Projector present visual stimulus
Moist paper tissue (Kimwipe) Kimtech Science 34155 Surgery: moist paper tissue
Motorized XY sample stage Zaber X-LRM050 Microscope
Neutral Density Filters (50% Transmission) Thorlabs NE203B present visual stimulus
Ø1/2" Post Holder ThorLabs PH1.5V Surgery: hollow tube for cannon
Ø1/2" Stainless Steel Optical Post ThorLabs TR150/M Surgery: fish loading module
Objective lens 16x, 0.8NA Nikon CF175 Microscope
Oil-based modeling clay Ly Hsin Clay C4086 Surgery: head bar holder
Optical adhesive Norland Products NOA68 Surgery: UV curable glue
Photomultiplier tube Hamamatsu H11706P-40 Microscope
Piezo actuator Physik Instrumente  P-725.4CA PIFOC Microscope
Pockels Cell Conoptics M350-80-LA-BK-02 Microscope
Red Wratten filter (> 600 nm) Edmund optics #53-699 present visual stimulus
Resonant-Galvo Scan System INSS RGE-02 Microscope
Right-Angle Clamp for Ø1/2" Post ThorLabs RA90/M Surgery: fish loading module
Rotating Clamp for Ø1/2" Post ThorLabs SWC/M Surgery: fish loading module
ScanImage MBF Bioscience Basic version Microscope
Semi-hexagonal tank custom made see supplemental files recording chamber
Super-Bond C&B Kit Sun Medical Co. Super-Bond C&B Surgery: dental cement
Tricaine methanesulfonate Sigma Aldrich E10521 Surgery: anesthetic
USB Camera FLIR BFS-U3-13Y3M-C Behavior recording
Vetbond 3M 1469SB Surgery: tissue glue

参考文献

  1. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
  2. Chow, D. M., et al. Deep three-photon imaging of the brain in intact adult zebrafish. Nature Methods. 17 (6), 605-608 (2020).
  3. Mittmann, W., et al. Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo. Nature Neuroscience. 14 (8), 1089-1093 (2011).
  4. Friedrich, R. W., Jacobson, G. A., Zhu, P. Circuit neuroscience in zebrafish. Current Biology. 20 (8), R371-R381 (2010).
  5. Kappel, J. M., et al. Visual recognition of social signals by a tectothalamic neural circuit. Nature. 608 (7921), 146-152 (2022).
  6. Bartoszek, E. M., et al. Ongoing habenular activity is driven by forebrain networks and modulated by olfactory stimuli. Current Biology. 31 (17), 3861-3874 (2021).
  7. Valente, A., Huang, K. H., Portugues, R., Engert, F. Ontogeny of classical and operant learning behaviors in zebrafish. Learning & Memory. 19 (4), 170-177 (2012).
  8. Buske, C., Gerlai, R. Maturation of shoaling behavior is accompanied by changes in the dopaminergic and serotoninergic systems in zebrafish. Developmental Psychobiology. 54 (1), 28-35 (2012).
  9. Huang, K. H., et al. A virtual reality system to analyze neural activity and behavior in adult zebrafish. Nature Methods. 17 (3), 343-351 (2020).
  10. Rupprecht, P., Prendergast, A., Wyart, C., Friedrich, R. W. Remote z-scanning with a macroscopic voice coil motor for fast 3D multiphoton laser scanning microscopy. Biomedical Optics Express. 7 (5), 1656-1671 (2016).
  11. Papadopoulos, I. N., Jouhanneau, J. -. S., Poulet, J. F. A., Judkewitz, B. Scattering compensation by focus scanning holographic aberration probing (F-SHARP). Nature Photonics. 11 (2), 116-123 (2017).
  12. Torigoe, M., et al. Zebrafish capable of generating future state prediction error show improved active avoidance behavior in virtual reality. Nature Communications. 12 (1), 5712 (2021).

Play Video

記事を引用
Bandonil, J. S., Liao, Y., Fathi, A., Huang, K. Two-Photon Calcium Imaging of Forebrain Activity in Behaving Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (197), e65526, doi:10.3791/65526 (2023).

View Video