Single-Copy Gene Locus Chromatine Zuivering in Saccharomyces cerevisiae

De dynamische organisatie van eukaryote genomen in chromatine comprimeert het DNA om binnen de grenzen van de kern te passen, terwijl het zorgt voor voldoende dynamiek voor genexpressie en toegankelijkheid voor regulerende factoren. Voor een deel wordt deze veelzijdigheid gemedieerd door het nucleosoom, de basiseenheid van chromatine, die bestaat uit een kerndeeltje met 147 bp DNA dat ~1,7 keer rond het histonoctameer¹ is gewikkeld. Het nucleosoom is een zeer dynamische structuur met betrekking tot zijn samenstelling, met talrijke histonvarianten en posttranslationele modificaties (PTM’s) op de N- en C-terminale histonstaarten. Bovendien interageert eukaryotisch chromatine met een groot aantal andere essentiële componenten, zoals transcriptiefactoren, DNA- en RNA-verwerkingsmachines, architecturale eiwitten, enzymen die betrokken zijn bij de remodellering en modificatie van chromatine, en RNA-moleculen die verband houden met chromatine. Deze cruciale machines die betrokken zijn bij transcriptie, replicatie en reparatie vereisen allemaal toegang tot chromatine, dat dient als het natuurlijke substraat voor deze processen. Bijgevolg vereist het begrijpen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan deze DNA-transacties een nauwkeurige definitie van de collectieve veranderingen in de chromatinestructuur in de specifieke genomische regio’s waar deze machines samenkomen en biologische reacties vergemakkelijken.

Ondanks de identificatie van talrijke chromatinefactoren door middel van genetica en eiwit-eiwitinteractiestudies, is het uitvoeren van directe, onbevooroordeelde en uitgebreide analyses van chromatine-interacties op bepaalde genomische locaties een belangrijk obstakel gebleven ^2,3. Aanvankelijk konden alleen zeer overvloedige regio’s van het genoom (d.w.z. repetitieve loci) of plasmiden met meerdere kopieën in voldoende hoeveelheden en zuiverheid worden geïsoleerd voor massaspectrometrische identificatie van de geassocieerde eiwitten 4,5,6,7. Een reeks nieuwe benaderingen op basis van de directe hybridisatie van capture-sondes tot gechromatineerd DNA, nabijheidsbiotinylering met behulp van het CRISPR-dCas9-systeem of de binding van sequentiespecifieke adaptereiwitten aan de locus van belang zijn begonnen met het ontrafelen van het proteoom van single-copy loci uit het genoom van gist en zoogdieren ^8,9,10. Al deze methoden vereisen echter formaldehyde-verknoping om de eiwit-DNA-interacties te stabiliseren en sonicatie om het chromatine op te lossen voor latere zuivering. Samen sluiten beide manipulaties de mogelijkheid uit van latere structurele en functionele studies van het gezuiverde chromatine.

Om deze beperkingen te overwinnen, hebben we eerder een methodologie bedacht die plaatsspecifieke recombinatie gebruikt om gerichte chromosomale domeinen uit gist^11,12 te extraheren. In wezen is het genomische gebied van belang omgeven door herkenningsplaatsen (RS) voor de plaatsspecifieke R-recombinase van Zygosaccharomyces rouxi, terwijl tegelijkertijd een groep van drie DNA-bindingsplaatsen voor het prokaryote transcriptionele repressor-LexA-eiwit (LexA) in dezelfde regio wordt opgenomen. De gistcellen bevatten een expressiecassette voor de gelijktijdige expressie van R-recombinase en een LexA-eiwit dat is gefuseerd met een tandem affiniteitszuivering (TAP)-tag. Na de inductie van R-recombinase snijdt het enzym het beoogde gebied efficiënt uit het chromosoom in de vorm van een cirkelvormig chromatinedomein. Dit domein kan worden gezuiverd via het LexA-TAP-adaptereiwit, dat zich bindt aan de LexA-DNA-bindingsplaatsen, evenals aan een affiniteitsondersteuning. Deze methode is onlangs gebruikt om verschillende chromatinedomeinen te isoleren die geselecteerde replicatie-oorsprong van gistchromosoom III¹³ bevatten.

Een groot voordeel van deze ex vivo benadering is dat het functionele analyses van het geïsoleerde materiaal mogelijk maakt. Replicatieoorsprongsdomeinen die met deze methode zijn gezuiverd, kunnen bijvoorbeeld worden onderworpen aan in-vitroreplicatietests om de efficiëntie van het afvuren van de oorsprong in een reageerbuis te beoordelen op basis van native in vivo geassembleerde chromatinesjablonen. Uiteindelijk kan de biochemische en functionele karakterisering van het geïsoleerde materiaal de reconstitutie van nucleaire processen mogelijk maken met behulp van gezuiverde eiwitten samen met het native chromatine-sjabloon. Samenvattend opent deze methodologie een opwindende weg in chromatine-onderzoek, omdat het mogelijk zal zijn om de collectieve samenstellings- en structurele chromatineveranderingen van een specifiek genoomgebied dat een bepaalde chromosomale transactie ondergaat, te volgen.