パーキンソン病モデルにおけるミトコンドリア形態の組織学的検討

このセクションに記載されているすべての手順は、バスク大学リファレンスM20/2022/212、バスク州政府、スペイン政府、および欧州連合によって提供された倫理的枠組みに従って実行されています。 1. SNCA過剰発現SH-SY5Y細胞におけるミトコンドリア形態解析 注:ここでは、その場で得られた結果の比較として役立つ、研究用のin vitro材料の生成の簡単な説明が提供されます。このタイプの分析は、ミトコンドリア形態のin vivo実験を開始する前に実行することをお勧めします。 細胞接着性を高め、平らな光学底部 96 ウェルプレートへの細胞接着を促進するには、25 μL/ウェルのコーティングマトリックス 1:1000 を DMEM F12 にピペッティングで添加します( 材料表を参照)。プレートを37°C、5%CO2で1時間インキュベートします。 ノイバウアーチャンバーを使用してSH-SY5Yをカウントします。ピペッティングでコーティングマトリックスを除去し、10% FBS、2 mMグルタミン、ペニシリン/ストレプトマイシンを添加した50 μL/ウェルのDMEM F-12を、コーティングされた96ウェルプレートに10.000細胞/ウェルを播種します( 材料表を参照)。 細胞を37°C、5%CO2で24時間インキュベートします。 ヒト野生型 SNCAを含むpcDNA3.1 250 ng、トランスフェクション試薬0.250 μL、トランスフェクションアジュバント0.250 L、トランスフェクション培地50 μLの混合物を各ウェルに調製します( 材料表を参照)。実験のウェルの総数を考慮してマスターソリューションを準備します。 手動ピペッティングで培地を除去し、ステップ1.4で調製した溶液を50μL/ウェルでピペッティングにより添加します。37°C、5%CO2でインキュベートします。 トランスフェクション後、ピペッティングでトランスフェクション培地を除去し、PBSに25 μL/ウェルの4%パラホルムアルデヒド(PFA)を添加します。注意:パラホルムアルデヒドは有毒な固定剤です。適切なPPEを使用してください。 室温(R.T)で5分間インキュベートします。ピペッティングで固定液を除去し、50 μL/ウェルのPBSを加えて1回洗浄します。ピペッティングでPBSを除去します。 25 μL/ウェルのTBSを0.05% Tween(TBS-T)および10%正常ロバ血清(NDS、 材料表を参照)とともにピペットで採取します。R.T.で1時間インキュベートし、非特異的なシグナルをブロックします。 ウサギ抗αシヌクレイン抗体MJFR1 1:1000とマウス抗TOMM20抗体1:100のTBS-T溶液( 材料表参照)を、分析するウェルの数に応じて調製します。 ステップ1.8のブロッキング溶液をピペッティングで除去し、ステップ1.9で調製した一次抗体の混合物を25 μL/ウェル加えます。4°Cで一晩インキュベートします。 一次抗体溶液を除去し、50 μL/ウェルのTBS-Tをピペッティングで添加および除去して3回洗浄します。 分析するウェルの数に応じて、TBS-T( 材料表参照)に、緑色の二次抗体抗マウス1:1000と赤色二次抗体抗ウサギ1:1000の溶液を調製します。 ステップ 1.11 で説明した最後の洗浄から PBS を吸引した後、ピペットを使用して二次抗体混合物 25 μL/ウェルを添加し、プレートを R.T. で 1 時間インキュベートします。 二次抗体溶液をピペッティングで除去し、TBS-Tに25 μL/ウェルの2 g/mL DAPIを加えます。プレートをR.T.で5分間インキュベートします。 ピペットを使用してDAPI溶液を除去し、ピペットで50μL/ウェルのTBS-Tを添加および除去して3回洗浄します。 PBS 80 μL/ウェルを 0.02% アジ化ナトリウムでピペットし、プレートを 4 °C で保存します。注意:アジ化ナトリウムは有毒です。適切なPPEを使用してください。 60倍対物レンズを搭載したハイコンテント自動蛍光顕微鏡または同等の共焦点イメージングシステムを使用して画像を撮影します( 材料表を参照)。 ステップ3.15-3.21に従って、フィジーを用いて単一細胞のTOMM20シグナルの解析を行います。アポトーシス、壊死、または有糸分裂を起こしている細胞は避けてください。注:そのために、細胞の収縮、膜のブレビング、細胞剥離、核の凝縮、DNA断片化、凝縮した核クロマチンが1つの平面に整列した太い鎖に組織化された凝縮など、顕微鏡で見えるアポトーシス、壊死、または有糸分裂の形態学的特徴を示す細胞を分析から除外します。 2. マウスにおけるPFFの作製とPFF頭蓋内注射 注:注入材料の生成と頭蓋内注入プロセスがここに示されています。このプロトコルは、Luk et al.25 から採用されています。 PFF を得るには、0.5 mL の α-Syn (5 mg/mL;ペプチド、 材料表を参照)を37°C、250rpmのシェーカーで7日間、α-シヌクレインの凝集を誘導しました。 凝集したα-シヌクレインを振幅20%、0.25サイクルデューティで超音波処理し、最適なフラグメンテーションが得られるまで超音波処理し、透過型電子顕微鏡によるサンプルのネガティブ染色によって観察します。 雌雄の野生型C57Bl/6マウス(3ヶ月齢)に線条体PFF注射を施すには、メロキシカム/メタカム(5mg/kg)を生理食塩水で皮下投与する。また、1匹につき0.5mLの皮下注射を2回 行い、 滅菌生理食塩水1mLを投与する。これらの治療は、脱水症状、炎症、痛みを防ぎます。 誘導チャンバー内で 4% イソフルランと 0.7 L/min O2 で麻酔を誘発します。ペダルの反応がないことで麻酔の深さを確認してください。 マウスの頭の上部を剃り、ヒートマットの上の定位装置のフレームに動物をそっと挿入します。 注射プロセス全体を通して、フェイスマスクを通して動物吸入麻酔(0.7 L / minO 2中の1%-2%イソフルラン)を提供することにより、麻酔面を維持します。. 定位フレームに動物を置きます。クロルヘキシジンスクラブと70%エタノールを交互に3回繰り返して手術部位を消毒します。マルカイン/ブピバカインを0.25%の皮下浸潤として局所的に(約100μL)塗布します。. 皮膚を0.5cm切開して頭蓋骨を露出させ、頭蓋骨に直径1mmの穴を開けて脳表面を露出させます。 ステップ 2.2 で定位送達により得られた PFF 1.5 L を、Bregma からステップ 2.8 で示した座標に、-2.7 mm 背腹側 (上部脳から) に 100 nl/分の流量で 32 G ハミルトン シリンジで注入します。注射後5分でシリンジを抜きます。 縫合糸(サイズ:4-0、45 cm、 材料表を参照)必要に応じて3〜5針で傷口を縫合し、それぞれを2つの二重結び目と1つの結び目で接着します。麻酔薬の吸入を中止し、マウスをフレームから取り外します。 マウスを適切な回復ケージに残してから、ホームケージに戻します。 翌週は、毎日の術後チェックを行います。動物の痛み、苦痛、または不快感は、ステップ2.3に示すように、24時間ごとにメロキシカム/メタカムを投与する必要があります。. 3か月後、腹腔内注射 により 、生理食塩水に200 mg / mLのペントバルビタールナトリウム300 μLを注射します。.痛み反射が失われたら、胸部を切開(2〜3cm)し、肋骨を持ち上げて心臓を露出させます。 23 G のバタフライニードルに接続された 50 mL シリンジを使用して、PBS 中の PBS 10 mL と PBS 中の 4% パラホルムアルデヒド 35 mL を 5 mL/分で次々と経心灌流します。 脳を除去し、4% PFAに後付けし、さらに4°Cで24時間加熱します。 PFA処理後、70%エタノール中で4°Cで保存してください。 脳を適切なプラスチック製の包埋ボックス( 材料表を参照)に入れ、R.T.で95%エタノールで1時間インキュベートします。 R.T.で脳を100%エタノールに移し、新鮮な100%エタノールでこのステップを繰り返し、再び1時間インキュベートします。 脳をキシレンまたはキシレン代替品に移し、R.T.で1時間、新鮮な溶液で繰り返し、再び1時間インキュベートします。 キシレンまたはキシレン代替品を除去し、サンプルを温かいパラフィン中で1時間インキュベートします。パラフィンを交換し、さらに1時間インキュベートします。 温かいパラフィンで包埋ボックスに脳をマウントし、一晩乾燥させます。ミクロトーム( 材料表参照)を用いて5μm切片を作製し、スライドガラスに取り付けます。 3. PFF注入マウスのパラフィン包埋脳切片の免疫組織化学によるミトコンドリア形態解析 キシレン代替品に10回浸してスライドを脱ワックスします。スライドをキシレン代替品で2分間インキュベートします。キシレン代替品に再度10回浸します。注:このステップは、パラフィンを除去し、サンプルの再水和を可能にするために必要です。 再水和:ステップ3.1で説明した手順を、100%EtOH、95%EtOH、70%EtOH、およびddH2Oで2回順に繰り返します。 以下の手順に従って抗原賦活化と免疫染色を行います。まず、サンプルをddH2Oの電子レンジ対応容器に移します。 4°Cで保存したpH 6のクエン酸100倍緩衝液( 材料表を参照)をウォームアップし(界面活性剤が沈殿している可能性があります)、350 mLの新鮮な1xクエン酸緩衝液を調製します。次に、クエン酸緩衝液を蓋付きの便利なプラスチック容器に注ぎます。 スライドをクエン酸緩衝容器に入れ(CRITICAL:スライドが緩衝液のレベルより下にあることを確認してください)、蓋をします。注意: 蓋が完全に閉まっていないことを確認してください、そうしないと、容器が電子レンジで破裂する可能性があります。 700 Wの電子レンジ:4分+5分休憩、1.5分+5分休憩。クエン酸緩衝液を補充し、再び電子レンジで1.5分+5分休憩、1.5分+5分休憩、1.5分+5分休憩します。 氷上のクエン酸緩衝液でサンプルを20分間冷却します。サンプルをddH2Oで洗浄します。注:抗原賦活化は、特定の抗体要件によって異なる場合があります。 ティッシュに触れずにペーパータオルでサンプルスライドを乾かします。組織の周りにパップペン( 材料表を参照)で長方形を描きます。 すべてのスライドをスライド免疫染色ボックスに移し、TBS + 0.05 % TWEEN(TBS-T)で数回穏やかに洗浄します。TBS-Tの液滴がパップペンの長方形の内側にとどまっていることを確認します。 ペーパータオルをタップして、サンプルからTBS-Tを取り除きます。50 μLのブロッキング溶液(TBS-T中の10%NDS)を各長方形に(組織に触れずに)添加し、室温で1時間インキュベートします。注:体積は組織のサイズによって異なる場合があります。(1)Pap-Penn の領域がサンプル間で類似していること、(2)選択したバッファー容量でその領域が完全に覆われていることを確認してください。 ペーパータオルを軽くたたいて、サンプルからブロッキング溶液を取り除きます。TBS-T中の一次抗体混合物50 μL/長方形を、抗チロシンヒドロキシラーゼ1:250と抗VDAC1 1:100および抗pSer129 α-シヌクレインEP1536Y 1:2000と一緒に静かにピペットで移動します( 材料表を参照)。 4°Cで一晩インキュベートします。 スライド上でTBS-Tをピペッティングして洗浄し、ペーパータオルを軽くたたいて取り除きます。これを3回繰り返します。 50 μL/矩形の二次抗体混合物(緑色の二次抗チキン、赤色の二次抗マウス、遠赤色の二次抗ウサギ 1:1000 TBS-T)をピペッティングして添加します( 材料表を参照)。暗所で37°Cで1時間インキュベートします。 手順3.13の説明に従って、TBS-Tで3回洗浄します。 DAPI 2 μg/mL in TBS-T で 1 分間インキュベートします。ペーパータオルをタップしてDAPI溶液を取り除きます。手順3.13の説明に従って、TBS-Tで3回洗浄します。 ガラスカバーガラスをサンプルに取り付け、スライド2滴の封入試薬を使用します( 材料表を参照)。カバーガラスを静かに押して気泡を除去し、サンプルをR.T.で1時間乾燥させ、その後、暗所で4°Cで保管します。 60倍オイル対物レンズまたは共焦点技術を備えた構造化照明蛍光イメージングシステムを使用して、異なるフィールドの少なくとも50個の細胞を画像化します。 以下のステップに示すように、Fijiを使用して単一細胞のVDAC1シグナルの解析を実行します。まず、(必要に応じて)正または負のセルの周囲に等高線を描き、「切り抜き」機能を使用して、 関心領域(ROI) を選択して分離します。ROI選択の偏りを避けるために、分析に関係のないマーカー(つまり、ミトコンドリアマーカーではない)の蛍光シグナルを考慮して選択します。 オプション:画像が過度にピクセル化されている場合は、「スムーズ」機能を使用して、より高いエッジ定義を取得します。注:スムーズ機能を画像に適用した場合は、後続のすべての画像に適用してください。 オプション: “Convolve” 関数 (カーネル モード、 プロセス > フィルター) を使用して、背景を減らします。注意: これはオプションであり、セクションが薄いため、5 mセクションを使用する場合は通常は必要ありません。 「測定の設定」機能で 形状記述子 と しきい値制限 オプションをアクティブにします(これらが解析を通じてアクティブになっていることを確認してください)。 「調整」メニューで、 しきい値機能 を選択し、しきい値レベルを調整します。閾値の設定は、同じサンプルのすべてのセルに対して維持する必要があります。この記事の代表的な画像に示されているように、ミトコンドリアネットワークを適切に視覚化し、背景ピクセルを破棄するようにしてください。 [解析]タブの [パーティクルの解析 ]ツールを使用します。ミトコンドリアを捕捉するために適切なサイズを設定します。この例では、size: 25-Infinity、activate: Pixel units、select: Show: Masks コマンドを使用して結果を視覚化しています。フィジーは、カウント、アスペクト比(AR)、およびその他の形状パラメータを計算して、新しいパネルに表示します。 必要に応じて、データの統計分析を実行します。この実験では、D’Agostino と Pearson の正規性検定による正規性検定の後、実験グループ間でフィジーが計算した平均アスペクト比 (AR) とカウントの差を分析するために t 検定を使用しました。