帕金森病模型中线粒体形态的组织学检查

本节中描述的所有程序均根据巴斯克地区大学参考 M20/2022/212、巴斯克地区政府、西班牙政府和欧盟提供的道德框架执行。 1. SNCA过表达SH-SY5Y细胞的线粒体形态分析 注意：这里提供了用于研究的 体外 材料的生成的简要说明，这将作为 原位 获得结果的比较。建议在启动线粒体形态 学的体内 实验之前进行此类分析，因为它将确保所有适当的成像和分析设置都到位。 为了增加细胞附着并促进细胞粘附在平坦的光学底部 96 孔板上，通过移液在 DMEM F12 中加入 25 μL/孔 1：1000 的涂层基质（参见 材料表）。将板在37°C和5%CO2下孵育1小时。 使用 Neubauer 腔室计数 SH-SY5Y。通过移液除去包被基质，并在补充有10S，2mM谷氨酰胺和青霉素/链霉素的50μL /孔DMEM F-12中将10.000个细胞/孔接种在包被的96孔板上（参见 材料表）。 将细胞在37°C和5%CO2下孵育24小时。 制备 250 ng 携带人野生型 SNCA、0.250 μL 转染试剂、0.250 L 转染佐剂和每孔最多 50 μL 的转染培养基的混合物（参见 材料表）。考虑实验中的孔总数，准备一个主解决方案。 通过手动移液除去培养基，并通过移液加入50μL/孔的步骤1.4中制备的溶液。在37°C，5%CO2孵育。 h 转染后，通过移液除去转染培养基，并在 PBS 中加入 25 μL/孔的 4% 多聚甲醛 （PFA）。注意：多聚甲醛是一种有毒的固定剂;使用适当的个人防护装备。 在室温（R.T）下孵育5分钟。通过移液除去固定溶液，并加入 50 μL/孔 PBS 洗涤一次。通过移液除去PBS。 用0.05%吐温（TBS-T）和10%正常驴血清（NDS，见 材料表）移液25μL/孔TBS。在R.T.孵育1小时以阻断任何非特异性信号。 根据要分析的孔数，在TBS-T中制备兔抗α-突触核蛋白抗体MJFR1 1：1000和小鼠抗TOMM20抗体1：100的溶液（见 材料表）。 通过移液除去步骤1.8中的封闭溶液，并加入25μL/孔的步骤1.9制备的一抗混合物。在4°C孵育过夜。 除去一抗溶液，通过移液加入和除去 50 μL/孔 TBS-T 洗涤 3 次。 根据要分析的孔数，在TBS-T中制备绿色二抗小鼠1：1000和红色二抗抗兔1：1000的溶液（见 材料表）。 从步骤1.11中描述的最后一次洗涤中抽吸PBS后，使用移液管加入25μL /孔的二抗混合物，并将板在RT下孵育1小时。 通过移液除去二抗溶液，并在 TBS-T 中加入 25 μL/孔的 2 g/mL DAPI。将板在R.T.孵育5分钟 使用移液管除去DAPI溶液，并用移液管加入和去除50μL /孔的TBS-T洗涤三次。 用0.02%叠氮化钠移液80μL /孔PBS，并将板储存在4°C。注意：叠氮化钠有毒;使用适当的个人防护装备。 使用配备60倍物镜的高内涵自动荧光显微镜或等效共聚焦成像系统捕获图像（参见 材料表）。 按照步骤 20-3.15 使用 Fiji 对单细胞的 TOMM3.21 信号进行分析。避免任何发生细胞凋亡、坏死或有丝分裂的细胞。注意：为此，我们从分析中排除了在显微镜下可见的细胞凋亡，坏死或有丝分裂的形态特征，例如细胞收缩，膜起泡，细胞脱离，核凝聚，DNA片段化和浓缩核染色质组织成在单个平面上排列的粗链。 2.小鼠PFFs和PFF颅内注射的产生 注意：此处介绍了注射材料的生成和颅内注射过程。该协议改编自Luk等人25。 要获得 PFF，请放置含有 0.5 mL α-Syn （5 mg/mL;肽，见 材料表）在37°C和250r.p.m.的振荡器上7天，以诱导α-突触核蛋白的聚集。 以 20% 振幅和 0.25 循环占空比对聚集的 α-突触核蛋白进行超声处理，直到达到最佳碎裂，并通过用透射电子显微镜对样品进行阴性染色来观察。 为了制备雄性和雌性野生型C57Bl / 6小鼠（3个月大）用于纹状体PFF注射，皮下注射盐水溶液中的美洛昔康/Metacam（5mg / kg）。此外，通过每只 动物两次 0.5 mL 皮下注射给予 1 mL 无菌盐水溶液。这些治疗可防止脱水、炎症和疼痛。 在诱导室中用 4% 异氟醚和 0.7 L/min O2 诱导麻醉。通过缺乏踏板响应来检查麻醉深度。 剃掉鼠标头部的上部，然后轻轻地将动物插入加热垫上的立体定向装置的框架中。 在整个注射过程中，通过面罩提供动物吸入麻醉（1%-2%异氟醚在0.7L / minO 2中）来维持麻醉平面。 将动物放在立体定向框架上。用三轮交替洗涤的洗必泰和 70% 乙醇对操作区域进行消毒。局部（约100μL）应用马卡因/布比卡因，皮下浸润0.25%。 在皮肤上做一个 0.5 厘米的切口以暴露颅骨，并在颅骨上钻一个直径为 1 毫米的孔以暴露脑表面，在 Bregma 的以下坐标中： – 前后 0.5 毫米，内侧 +/− 2.5 毫米。 用 1.5 g Hamilton 注射器以 100 nl/min 的流速将步骤 2.2 通过立体定向递送至步骤 2.8 中指示的 Bregma 和 -2.7 mm 背腹侧（来自顶部大脑）的 32 L PFF 注入步骤 32 L。注射后5分钟取出注射器。 根据需要缝合伤口（尺寸：4-0,45厘米，见 材料表）缝合三到五针，并用2个双结和单结将每个伤口粘合。停止吸入麻醉剂并将鼠标从框架中取出。 将鼠标留在适当的恢复笼中恢复，然后再将其放回主笼中。 在接下来的一周内，每天进行术后检查。任何动物的疼痛、痛苦或不适都应每 24 小时服用一次美洛昔康/Metacam，如步骤 2.3 所示。 三个月后， 通过 腹腔注射在生理盐水溶液中注射 300 μL 200 mg/mL 戊巴比妥钠。一旦疼痛反射消失，在胸部做一个切口（2-3厘米），然后抬起肋骨，露出心脏。 使用连接到 23 G 蝶形针头的 50 mL 注射器，用 10 mL PBS 和 35 mL 4% 多聚甲醛在 PBS 中以 5 mL/min 的速度依次灌注。 在4°C下去除脑和后缀在4%PFA中再放置24小时。 PFA处理后将其储存在4°C的70%乙醇中。 将大脑放入适当的塑料包埋盒中（参见 材料表），并在RT中在95%乙醇中孵育1小时，在新鲜的95%乙醇中重复该步骤并再次孵育1小时。 在R.T.下将大脑转移到100%乙醇中1小时，在新鲜的100%乙醇中重复该步骤并再次孵育1小时。 将大脑转移到二甲苯或二甲苯替代品中1小时，在新鲜溶液中重复并再次孵育1小时。 除去二甲苯或二甲苯替代品，并将样品在温石蜡中孵育1小时。更换石蜡并再孵育一小时。 用温热的石蜡将大脑安装在包埋盒上，让它干燥过夜。使用切片机准备5μm切片（参见 材料表）并将它们安装在载玻片上。 3. 通过免疫组化对PFF注射小鼠石蜡包埋的脑切片进行线粒体形态分析 通过浸入二甲苯替代品十次来为载玻片脱蜡。将载玻片在二甲苯替代品中孵育2分钟。在二甲苯替代品中再次浸泡十次。注意：此步骤对于去除石蜡并实现样品的再水化是必要的。 补液：使用以下溶液重复步骤3.1中描述的过程：100%EtOH，95%EtOH，70%EtOH，并依次使用ddH2O进行两次。 按照以下步骤进行抗原修复和免疫染色。首先将样品转移到ddH2O的微波炉容器中。 预热100x柠檬酸盐缓冲液pH 6（参见 材料表），储存在4°C（洗涤剂可能已沉淀）并制备350mL新鲜的1x柠檬酸盐缓冲液。然后将柠檬酸盐缓冲液倒入带盖的方便塑料容器中。 将载玻片放入柠檬酸盐缓冲液容器中（严重：检查载玻片是否低于缓冲液的水平）并盖上盖子。注意： 确保盖子没有完全关闭，否则容器可能会在微波炉中爆裂。 700 W 的微波炉：4 分钟 + 5 分钟休息，1.5 分钟 + 5 分钟休息。再次补充柠檬酸盐缓冲液和微波炉 1.5 分钟 + 5 分钟休息，1.5 分钟 + 5 分钟休息，1.5 分钟 + 5 分钟休息。 将样品在冰上的柠檬酸盐缓冲液中冷却20分钟。用ddH2O洗涤样品。注意：抗原修复可能因特定抗体要求而异。 用纸巾擦干样品载玻片，不要接触纸巾。用巴氏笔（见 材料表）在组织碎片周围绘制矩形。 将所有载玻片转移到载玻片免疫染色盒中，并用TBS + 0.05%吐温（TBS-T）轻轻洗涤几次。检查 TBS-T 液滴是否留在 pap-pen 矩形内。 通过敲击纸巾从样品中取出 TBS-T。向每个矩形中加入50μL封闭溶液（TBS-T中的10%NDS）（不接触组织），并在室温下孵育1小时。注意：体积可能因组织的大小而异;尽量确保：（1） 不同样品的巴氏涂片区域相似，以及 （2） 所选缓冲液体积完全覆盖该区域。 通过敲击纸巾从样品中去除封闭溶液。轻轻移液50μL/矩形的TBS-T中以下一抗混合物：抗酪氨酸羟化酶1：250与抗VDAC1：100和抗pSer129 α-突触核蛋白EP1536Y 1：2000（参见 材料表）。 在4°C孵育过夜。 通过在载玻片上移液 TBS-T 进行清洗，然后通过敲击纸巾将其取出。重复三次。 通过移液 50 μL/矩形的二抗混合物加入：绿色二抗鸡、红色二抗小鼠和远红色二抗兔 1：1000 在 TBS-T 中（参见 材料表）。在37°C下在黑暗中孵育1小时。 如步骤3.13所述，用TBS-T洗涤三次。 在 TBS-T 中与 DAPI 2 μg/mL 孵育 1 分钟。通过敲击纸巾去除DAPI溶液。如步骤3.13所述，用TBS-T洗涤三次。 使用2滴/载玻片的安装试剂将玻璃盖玻片安装在样品上（参见 材料表）。轻轻按压盖玻片以消除气泡，并让样品在R.T.下干燥1小时，然后，在4°C的避光下储存。 使用配备 60 倍油物镜或共聚焦技术的结构照射荧光成像系统对不同区域的至少 50 个细胞进行成像。 使用Fiji对单细胞的VDAC1信号进行分析，如以下步骤所示。首先，通过在正或负单元格周围绘制轮廓（视情况而定）并使用“裁剪”功能来选择和隔离 感兴趣区域 （ROI ）。为了避免ROI选择中的偏差，通过考虑与分析无关的标记物（即不是线粒体标记物）的荧光信号来选择它。 可选：如果图像像素化程度过高，请使用“平滑”功能获得更高的边缘清晰度。注意：如果将平滑功能应用于图像，请将其应用于所有后续图像。 可选：使用“卷积”功能（内核模式， 在进程>过滤器中）来减少背景。注意： 这是可选的，由于截面较薄，因此在使用 5 m 截面时通常不需要。 激活 形状描述符 ，并将“设置测量值”功能 上的阈值选项限制为阈值 （确保通过分析激活这些选项）。 在“调整”菜单中，选择 阈值功能 并调整阈值级别。必须保持同一样品的所有细胞的阈值设置。尝试确保线粒体网络的充分可视化，如本文的代表性图像所示，同时丢弃背景像素。 使用分析选项卡上的 分析粒子 工具。设置适当的大小以捕获线粒体。在此示例中，size： 25-Infinity，激活： 像素单位，然后选择： 显示：蒙版 命令用于可视化结果。Fiji 将在新面板中计算并显示计数、纵横比 （AR） 和其他形状参数。 根据需要对数据进行统计分析。在本实验中，使用t检验分析了使用D’Agostino和Pearson正态性检验进行正态性检验后，实验组之间Fiji计算的平均纵横比（AR）和计数的差异。