Análisis automatizado optimizado de la modulación de la homeostasis de las mitocondrias neuronales vivas mediante receptores de ácido retinoico específicos de isoformas

Las mitocondrias celulares se encuentran en el centro de todos los estados fisiológicos, y una comprensión profunda de su homeostasis (mitástasis) y comportamiento es primordial para ayudar a identificar el tratamiento farmacológico para una amplia gama de enfermedades, incluyendo el cáncer y la enfermedad de Alzheimer ^1,2.

Las mitocondrias desempeñan un papel celular crucial en la homeostasis energética, la generación de ATP, la amortiguación del calcio y la regulación de ROS, y la mitostasis es esencial para mantener la homeostasis de las proteínas, ya que las chaperonas moleculares dependen de la energía³. Estos requieren una modulación y adaptación de red constante y dinámica para satisfacer eficientemente las necesidades celulares, y el transporte de mitocondrias está regulado por diferentes vías de señalización; Trabajos previos han descrito una de estas vías, la de los receptores de ácido retinoico (RARs^)4,5. El ácido retinoico (AR) promueve el crecimiento axonal y de neuritas a través de la activación de RAR. En las neuronas corticales primarias de ratón, la activación de RAR-β estimula el crecimiento, la velocidad y la movilidad mitocondrial en la neurita⁶.

Teniendo en cuenta la adaptabilidad y la dinámica de la red mitocondrial, la posibilidad de evaluar la mitostasis en “tiempo real” es esencial no solo para investigar la homeostasis energética, sino también para la proteostasis, la salud celular, la proliferación o la señalización. Un método comúnmente utilizado para evaluar la mitostasis se basa en la microscopía confocal después de resaltar las mitocondrias utilizando un colorante o marcador fluorescente, así como una configuración de microscopía específica que permite la regulación de la temperatura y/o el_CO2 ⁷. Este tipo de configuración experimental implica que se realice una réplica experimental a la vez. Además de la repetición experimental de diferentes tratamientos, se debe considerar que la mayoría de los experimentos deben tener sus réplicas técnicas (donde se visualiza más de una posición por placa), con una serie de planos focales (pilas z) que se registran en una serie de puntos de tiempo. Así, un diseño experimental con tres repeticiones de un control y dos tratamientos, con cinco posiciones de imagen por placa, y 15 puntos de tiempo, da como resultado 225 pilas a procesar. Clásicamente, los videos de mitocondrias vivas se analizaban mediante el trazado de quimógrafos, que se analizaban individualmente⁸, en un proceso que consumía mucho tiempo y que requería una amplia entrada manual, incluso cuando se dependía de herramientas informáticas.

Recientemente se ha descrito un algoritmo⁹ que permite la segmentación y el seguimiento automatizados de las mitocondrias en archivos time-lapse 2D y 3D de células vivas. Existen otras técnicas de cuantificación y todas tienen sus limitaciones¹⁰. Mitometer, una aplicación automatizada de código abierto, es particularmente adecuada para el análisis de lapso de tiempo y dinámica mitocondrial, que requiere poca participación del usuario. Esta aplicación tiene una serie de ventajas frente a otras herramientas existentes basadas en MATLAB, a saber, permite el procesamiento automático de pilas TIF individuales, utilizando hasta 13 parámetros diferentes, especialmente interesante para las neurociencias, ya que diferencia entre mitocondrias perinucleares y telenucleares.

Sin embargo, para un experimento como el descrito anteriormente, estos 13 parámetros aplicados a 225 pilas dan como resultado 2.925 archivos de salida individuales. Estos requieren cuatro entradas individuales de computadora, que suman más de 10,000 entradas manuales que se requieren para descargar todos los archivos de salida. En el caso de los diseños experimentales de gran envergadura, esto da lugar a un análisis de cada archivo e integración de datos que requiere mucho tiempo. En este trabajo presentamos una optimización rutinaria que permite un análisis rápido de archivos, reduciendo en gran medida la lectura de documentos y el procesamiento de datos, analizando los datos de una manera definida, consistente con la salida de las herramientas existentes.