La profilazione polimerica microarray (MAPP) è una tecnica ad alto rendimento per l’analisi della composizione dei glicani in campioni biologici.
La profilazione polimerica con microarray (MAPP) è un approccio robusto e riproducibile per determinare sistematicamente la composizione e l’abbondanza relativa di glicani e glicoconiugati all’interno di una varietà di campioni biologici, inclusi tessuti vegetali e algali, materiali alimentari e campioni umani, animali e microbici. La tecnologia Microarray è alla base dell’efficacia di questo metodo fornendo una piattaforma di screening miniaturizzata e ad alto rendimento, che consente di caratterizzare contemporaneamente migliaia di interazioni tra glicani e sonde molecolari dirette da glicani altamente specifiche, utilizzando solo piccole quantità di analiti. I glicani costituenti vengono frazionati chimicamente ed enzimaticamente, prima di essere estratti sequenzialmente dal campione e immobilizzati direttamente su membrane di nitrocellulosa. La composizione dei glicani è determinata dall’attaccamento di specifiche sonde molecolari che riconoscono i glicani alle molecole estorte e stampate. MAPP è complementare alle tecniche convenzionali di analisi dei glicani, come l’analisi dei monosaccaridi e dei linkage e la spettrometria di massa. Tuttavia, le sonde molecolari che riconoscono i glicani forniscono informazioni sulle configurazioni strutturali dei glicani, che possono aiutare a chiarire le interazioni biologiche e i ruoli funzionali.
I glicani sono onnipresenti in tutti i domini della vita e mostrano una diversità senza precedenti nella struttura e nella funzione rispetto ad altremacromolecole. Tuttavia, a causa della loro complessità, della variabilità nella biosintesi e nei legami glicosidici e della scarsità di metodi appropriati per sezionare le strutture dei glicani, la nostra comprensione di questa diversità nelle strutture e nelle funzioni èrelativamente limitata.
Molte tecniche di analisi dei glicani sono distruttive e richiedono la scomposizione dei glicani nei loro monosaccaridi costituenti, che possono oscurare contesti tridimensionali e biologici rilevanti3. Al contrario, gli anticorpi monoclonali (mAb), i moduli leganti i carboidrati (CBM), le lectine, le agglutinine virali e le adesine microbiche, note collettivamente come sonde molecolari che riconoscono i glicani (GRMP)4, riconoscono e si legano a epitopi specifici e possono essere utilizzati come strumenti per rilevare e discriminare tra glicani all’interno di matrici multiglicaniche complesse 5,6.
In questo articolo presentiamo il microarray polymer profiling (MAPP), un metodo rapido, versatile e non distruttivo per l’analisi dei glicani, applicabile a un ampio spettro di campioni biologici. Il metodo mira a fornire una tecnologia robusta e ad alto rendimento per l’analisi dei glicani da diversi sistemi biologici e industriali/commerciali. MAPP unisce la specificità di riconoscimento delle sonde molecolari dirette da glicani con una tecnologia di screening microarray riproducibile e ad alte prestazioni per consentire il profilo di migliaia di interazioni molecolari in parallelo. Il risultato di questo approccio è l’intuizione diagnostica della composizione e dell’abbondanza relativa di glicani all’interno di un campione o di un tessuto di interesse.
MAPP può essere utilizzato come metodo indipendente, stand-alone, o in combinazione con altre tecniche biochimiche, come la microscopia a immunofluorescenza 7,8,9 e l’analisi monosaccaridica o di linkage10,11. La tecnica può anche essere utilizzata per mappare le specificità degli epitopi dei nuovi GRMP, utilizzando array stampati con standard di oligosaccaridi puri e strutturalmente ben definiti12. Uno dei principali vantaggi di MAPP rispetto ad altri metodi, come il saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA), è la sua compatibilità con piccoli volumi di campione13,14. Inoltre, MAPP offre un’analisi a produttività significativamente più elevata15 e fornisce una forma efficace di conservazione dei campioni, poiché i campioni stampati sono asciutti e stabili quando immobilizzati su nitrocellulosa16.
Il legame dei GRMP dipende generalmente dalla presenza di un certo numero di residui zuccherini contigui che formano collettivamente un sito di legame (epitopo) che è unico per una particolare classe di polisaccaridi (xilano, mannano, xiloglucano, ecc.) 17. Al contrario, i singoli residui zuccherini (xilosio, mannosio, glucosio) quantificati utilizzando la maggior parte delle tecniche biochimiche, ad esempio la composizione dei monosaccaridi o l’analisi della metilazione, possono essere componenti di più classi di polisaccaridi e quindi difficili da assegnare18.
MAPP è stato sviluppato in risposta a una lacuna tecnologica, vale a dire la capacità di analizzare rapidamente più glicani da una varietà di fonti utilizzando piccole quantità di materiale. MAPP capitalizza l’ampio repertorio di GRMP che sono stati sviluppati e caratterizzati negli ultimi tre decenni 12,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32. Lo sviluppo di MAPP è stato un processo iterativo, con la tecnica costantemente perfezionata e ottimizzata. Esiste ora una notevole letteratura che descrive l’applicazione di MAPP a vari sistemi naturali e industriali in cui i glicani svolgono ruoli centrali 5,6,9,10,21,33,34,35,36,37,38,39. Qui descriviamo lo stato attuale dell’arte di MAPP.
La tecnica MAPP qui descritta è ormai un metodo consolidato per l’analisi dei glicani. I principi di base sono stati descritti per la prima volta nel 200711, ma la tecnica ha subito un continuo sviluppo al fine di capitalizzare le ultime innovazioni nella tecnologia dei microarray, lo sviluppo di sonde molecolari e i progressi nella nostra comprensione della biochimica dei glicani. In generale, i glicani, in particolare i polisaccaridi, sono più difficili da analizzare rispetto alle proteine e ai nucleotidi a causa della loro complessità strutturale ed eterogeneità45, nonché del fatto che non possono essere facilmente sequenziati o sintetizzati1. In molti casi, nessuna singola tecnica può decifrare in modo definitivo la complessità dei glicani; pertanto, MAPP viene spesso utilizzato con altri metodi. Questo è uno dei motivi per cui la preparazione dell’AIR viene solitamente scelta come punto di partenza per MAPP, poiché l’AIR è compatibile con la maggior parte degli altri metodi di analisi dei glicani34, facilitando il successivo confronto dei set di dati.
A causa dell’omogeneizzazione del campione prima della preparazione dell’aria, alcune informazioni spaziali vengono invariabilmente perse. Tuttavia, poiché i polisaccaridi vengono rilasciati sequenzialmente dai campioni, la presenza di epitopi nelle frazioni ottenute fornisce informazioni sull’architettura molecolare e sulla composizione di quel campione17. Pertanto, la selezione di un regime di estrazione appropriato è fondamentale per il successo del metodo. Diversi parametri determinano l’idoneità del metodo di estrazione: struttura cellulare, tempo, temperatura, pH, pressione, forza ionica del solvente e finezza del campione di particolato solido49. Si raccomanda di utilizzare una gamma di solventi sempre più aggressivi per massimizzare la probabilità di estrarre con successo i glicani costituenti e costruire un quadro compositivo rappresentativo del campione. Per la maggior parte dei campioni, CDTA, NaOH e cellulasi sono sufficienti per rimuovere i polisaccaridi di origine vegetale e della parete cellulare 33,50,51,52. Per alcuni campioni di tessuto, un regime di estrazione ibrido che include anche CaCl2, HCl e Na2CO3 ha dimostrato di avere successo53, mentre i campioni di microalghe marine possono richiedere l’aggiunta di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)10.
I microarray dovrebbero includere una serie di standard di glicani puri e definiti da utilizzare come controlli positivi5. Le norme incluse devono essere modificate in base alla natura del campione. Una volta stampato, è necessario selezionare i GRMP appropriati. La generazione di anticorpi monoclonali ibridomi in strutture polisaccaridicheè impegnativa 54; Gli anticorpi leganti i glicani sono difficili da allevare e possono avere una bassa affinità55. Fortunatamente, le informazioni sulla sequenza genica per i CBM possono essere ottenute con relativa facilità per l’espressione ricombinante4 e l’ingegnerizzazione delle loro specificità di legame56,57. Sebbene sia stato sviluppato un impressionante catalogo di GRMP, la maggior parte dei quali è ora disponibile da fonti commerciali, in relazione alla diversità delle strutture glicaniche esistenti in natura, solo una piccola parte è stata prodotta e caratterizzata con successo58. Ciò può limitare la capacità di rilevare e discriminare tra determinate strutture. Si consiglia di eseguire un primo esperimento di sondaggio utilizzando una o due sonde rappresentative di ciascuna struttura glicana principale che si prevede sia presente, per la quale la specificità di legame è ben caratterizzata. Nei successivi esperimenti di sondaggio, l’elenco delle sonde può essere ampliato per coprire una gamma più ampia di glicani e approfondire le strutture fini.
Anche se banale, garantire che i microarray vengano lavati accuratamente dopo ogni fase di incubazione è fondamentale per il successo della procedura di sondaggio. La rimozione inefficace di sonde non legate in modo specifico rischia di oscurare il risultato causando un segnale di fondo elevato dopo lo sviluppo del colore. In questo caso, è necessario ripetere la procedura di sondaggio, iniziando con un nuovo microarray. Inoltre, le matrici devono essere toccate con parsimonia e solo tenendo i bordi con una pinza; La membrana in nitrocellulosa è fragile e si danneggia facilmente. La soluzione per lo sviluppo del colore si accumula in crepe e pieghe, causando una sovrasaturazione, che impedisce l’analisi dell’array.
MAPP è veloce, adattabile e conveniente. Questo metodo è compatibile con glicani animali, microbici o vegetali derivati da qualsiasi sistema biologico o industriale, purché possano essere estratti e immobilizzati su nitrocellulosa, e per i quali si disponga di apposite sonde molecolari. I dati generati forniscono informazioni dettagliate, semi-quantitative, composizionali, che non possono essere facilmente ottenute tramite altri metodi di analisi dei glicani.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori ringraziano ArrayJet per la sua consulenza esperta in materia di robotica microarray. SS e JS desiderano riconoscere il sostegno del Fondo fondamentale 2022 (FF65/004), Università di Chiang Mai.
1,3:1,4-β-D-Glucan, Lichenan (icelandic moss) | Megazyme | P-LICHN | |
1,4-β-D-Mannan | Megazyme | P-MANCB | |
384-well microtiter plate | Greiner Bio-One | M1686 | |
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) | Melford | B74100-1.0 | |
Acetone | Sigma | 270725 | |
Alkaline Phosphatase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-055-003 | |
Alkaline Phosphatase AffiniPure Goat Anti-Rat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 112-055-003 | |
Alkaline Phosphatase AffiniPure Rabbit Anti-His Tag | Jackson ImmunoResearch | 300-055-240 | |
Arabinoxylan (wheat) | Megazyme | P-WAXYL | |
Array-Pro Analyzer Software | Media Cybernetics | Version 6.3 | |
Bacillus sp. Cellulase 5A (BCel5A) | NZYTech | CZ0564 | |
BAM antibodies | SeaProbes | Various | |
Black drawing ink (indian ink) | Winsor & Newton | GWD030 | |
Carbohydrate binding modules | NZYTech | Various | |
CCRC antibodies | CarboSource | Various | |
CDTA | Sigma | 319945 | |
Chloroform | Sigma | PHR1552 | |
Ethanol | Sigma | 1.11727 | |
Galactan (potato) | Megazyme | P-GALPOT | |
Galactomannan (carob) | Megazyme | P-GALML | |
Glycerol solution | Sigma | 49781-5L | |
Gum tragacanth (legumes) | Sigma-Aldrich | G1128 | |
INCh antibodies | INRA | Various | |
LM and JIM antibodies | PlantProbes | Various | |
Marathon Argus Microarray Printer | ArrayJet | ||
Methanol | Sigma | 34860 | |
Monoclonal antibodies | Biosupplies Australia | Various | |
NaBH4 | Sigma | 452882 | |
NaOH | Sigma | S5881 | |
Nitro-blue tetrazolium (NBT) | Melford | N66000-1.0 | |
Nitrocellulose membrane | Thermo Fisher Scientific | 88018 | |
Pectin (degree of methyl esterification 46%) | Danisco | NA | |
ProClin 200 | Sigma | 48171-U | |
Rhamnogalacturonan (soybean pectic fibre) | Megazyme | P-RHAGN | |
Rotating mixer | Fisher Scientific | 88-861-050 | |
Rotating/rocking Shaker | Cole-Parmer | ||
Skimmed milk powder | Marvel | ||
Spin filter | Costar Spin-X | 8160 | |
Stainless steel beads | Qiagen | 69989 | |
TissueLyser II | Qiagen | 85300 | |
Tris | Sigma | 93362 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787-250ML | |
Tween 20 | Sigma | P9416-100ML | |
Xylan (beechwood) | Megazyme | P-XYLNBE | |
Xyloglucan (tamarind) | Megazyme | P-XYGLN | |
β-Glucan (oat) | Megazyme | P-BGOM |