斑马鱼鳞片再生 在多多 和 离体 鳞片培养中

大学动物科学部门 （ASU） 在斑马鱼饲养指南的指导下负责斑马鱼护理。所有程序，包括鳞片采集、活体骨染色和活体成像，均在英国内政部项目许可证 （PP4700996） 下获得批准和执行。对于这份手稿，使用了来自sp7：mCherry [Tg（osterix：mCherry-NTR）pd46]系的年轻成年转基因斑马鱼17。这些鱼包括4个月大的雄性和雌性。 1. 体内 规模再生 在开始鳞片再生实验之前，将斑马鱼从其主水箱转移到单独的水箱中（见 材料表），并在整个实验过程中成像后返回这些单独的水箱，如 图2所示。这是为了确保所有再生鳞片都是为实验收获的鳞片;由于其他鱼类造成的伤害，群居会导致鳞片的零星脱落。注意：鱼是单独放置的，以避免鱼之间的战斗和随后的鳞片损失。 根据实验设计记录每种实验鱼的信息（即基因型、年龄和性别）。使用相机（智能手机相机工作正常）在尺子旁边拍摄每条鱼的图像，以记录鱼的大小/长度和健康状况。 在实验当天，使用0.05%（v / v）三卡因甲烷磺酸盐（MS222，见 材料表）浸泡麻醉斑马鱼，然后将其放置在带有湿组织的培养皿上，以避免鱼在成像或收获过程中移动。 将鱼侧放（通常使用左翼以保持一致性）。使用具有适当放大倍率的体视显微镜进行侧翼成像（通常，本研究使用 2 倍、4 倍和/或 6.3 倍和 8 倍来捕获整体再生区域和放大区域以进行详细观察）。注意：侧翼成像时间点取决于实验目的和转基因报告基因的选择。例如，为了在鳞片再生期间跟踪成骨细胞，建议的时间点是第 0 天（个体发育）、收获后 2 天 （dph）、4 dph、7 dph、10 dph、14 dph、21 dph。为了减少重复麻醉的影响，请将成像时间点保持在实验所需的最少时间。 在立体显微镜下使用细镊子和镊子收获鳞片。将收获的鳞片转移到收集管中，以便稍后进行鳞片染色。注意：可以收获的最大秤数量将取决于当地的道德批准。我们通常收获大约 20 到 30 个鳞片，并将它们收集到单独的收集管中，以便稍后进行鳞片染色，例如 ALP、von Kossa14。 将鳞片收集到 1.5 mL 或 2 mL 收集管中。这取决于所使用的染色技术。对于ALP和von Kossa染色，将鳞片转移到含有去离子水的收集管中，而对于TRAP染色或免疫组化，将鳞片转移到含有4%PFA（固定溶液）的收集管中。 可选：在将鳞片转移到试管中之前，如果需要，可以捕获单个收获的鳞片的图像。注意：建议的鳞片收获时间点是第 0 天（个体发育）、第 10 天和第 21 天（再生鳞片）。 2.活体骨染色 注意：当实验鱼不是荧光报告基因的转基因或携带单色转基因报告基因时，可以进行活骨骼染色。活染色可用于补充转基因;例如，可以使用一种颜色（例如GFP）的成骨细胞报告基因（例如sp7 / osx ），然后用茜素红（AR）将骨染成红色。AR和钙黄绿可以一起用于同一条鱼;在这种情况下，AR通过与老化骨的矿化基质结合来标记原始或个体发育的骨，而钙黄绿素则与新形成的骨中丰富的钙离子结合。例如，当对个体发育鳞片进行染色时，可以观察到 AR，但钙黄绿可能不存在或很少，因为个体发育鳞片的新骨形成水平较低。 进行实时茜素红 （AR） 染色。通过将 0.5% （w/v） 原液茜素溶液 （10 mL） 与 10 mL 1 M 原液 HEPES（终浓度，10 mM）混合来制备一瓶 2x AR 染色溶液（参见 材料表）。 用 1x Danieau 溶液加注至 1 L（参见 材料表）。溶液必须保持在黑暗中或用箔纸包裹。 在实验当天，将 500 mL 的 2x AR 溶液带到斑马鱼设施中，并加入 500 mL 系统水（来自水族箱）制成 1x 工作 AR 溶液。 将鱼从鱼缸中转移到 1x 工作 AR 染色溶液中，静置 15-20 分钟。在系统水中“洗涤”15分钟，洗掉鱼上多余的污渍。 进行活焦绿绿素染色。通过将 45 mg 钙黄绿素粉末加入 900 mL 1x Danieau 溶液中来制备一瓶 2x 钙黄绿绿染色溶液（参见 材料表）。使用磁力搅拌器使粉末完全溶解。 将pH值调节至8。这是 2x 库存钙黄绿素溶液。该溶液可以在黑暗中储存/用箔纸包裹长达 1 个月。 在实验当天，将 500 mL 的 2x 钙黄绿绿溶液带到斑马鱼设施中，并加入 500 mL 系统水制成 1x 工作钙黄绿素溶液。建议使用新鲜制备的钙黄绿素染色液。 将鱼从水箱中转移到1x工作钙黄绿染色溶液中，并放置1-2小时。根据鱼的大小，可能需要更长的染色时间。 在系统水中“洗涤”15分钟，洗掉鱼身上多余的污渍。注意：尽快对钙黄绿染色的鱼进行成像，因为这种染色会在几个小时内褪色。 3. 收获后鳞片上的碱性磷酸酶（ALP）染色 通过将 100 mM Tris（pH 9.5 与 HCl）与 100 mM NaCl 和 50 mM MgCl2 混合来制备 ALP 染色溶液。 使用市售的NBT/BCIP储备溶液（见 材料表）。 将秤转移到装有去离子水的试管中。 在ALP染色溶液中冲洗鳞片5分钟。 同时，将 200 μL NBT/BCIP 溶液加入 10 mL ALP 染色缓冲液中，制备工作染色溶液。这需要在染色时新鲜制备。 用有效的ALP染色溶液染色秤15分钟。 用去离子水冲洗鳞片，停止反应。 4. 收获后对鳞片进行 Von KOSSA 染色 制备5%（w / v）硝酸银溶液。 制备5%（w / v）硫代硫酸钠溶液。 将收获的鳞片转移到装有去离子水的试管中。 将鳞片在硝酸银溶液中在强光下孵育40分钟。注意： 穿戴 PPE（个人防护设备），因为硝酸银会留下难以去除的污渍。 用去离子水清洗秤两次，持续5分钟。注意：硝酸银废物必须根据当地指南进行收集和处置。 将鳞片在硫代硫酸钠中孵育5分钟。 用去离子水清洗秤两次，持续5分钟。 5. 比色TRAP染色 注：有关详细程序，请参阅以前发表的工作18。 准备染色溶液。制备 10 mg/mL 萘酚 AS-MX 磷酸盐溶液。称取5mg萘酚AS-MX磷酸盐（见 材料表）。 在通风橱中，制备装有0.5mL N，N’-二甲基甲酰胺的试管，并将5mg萘酚AS-MX磷酸盐溶解在0.5mL N，N’-二甲基甲酰胺中，制成10mg / mL萘酚AS-MX磷酸盐的储备溶液（轻轻摇动）。 在 50 mM 酒石酸钠中制备 1.6 mM Fast Red Violet LB 储备溶液。在 pH 5 下制备 50 mL 0.1 M 乙酸钠（在 50 mL 去离子水中加入 0.41015 g 乙酸钠，并用 100% 乙酸调节 pH 至 5）。 将0.575g酒石酸钠二水合物（参见 材料表）溶于50mL0.1M乙酸钠缓冲液（pH=5）中。 加入 30 毫克快速红紫 LB 盐。 制备PBS-0.1Tx（将500μLTriton-X溶解在500mL PBS中）。制备PBS-0.1Tw（将500μL吐温-20溶解在500mL PBS中）。 准备一个有效的 TRAP 溶液。在通风橱中将两种储备溶液混合在一起（0.5 mL 10 mg/mL 萘酚 AS-MX 磷酸盐溶液和 50 mL 1.6 mM Fast Red Violet LB 储备溶液在 50 mM 酒石酸钠中）。注意： 工作溶液现在可以在通风橱外使用。它可以存放在冰箱中（用箔纸包裹）长达一个月。与抗体或其他对固定剂敏感的试剂分开存放。尽可能远离光线。 可选：在PBS和0.1%Tween-20（PBS-0.1%Tw）中制备漂白溶液（在经过TRAP染色的后固定样品上）。 制备 0.5% 氢氧化钾 （KOH）（来自 10% 储备溶液 （w/v））和 3% 过氧化氢 （H2O2）（33% 储备溶液，储存在冰箱中）的最终浓度混合物。 执行样品固定。在室温（RT）下将刻度固定在1x PBS中的4%PFA中，摇摆或旋转40分钟。 除去 4% PFA，用 PBS-0.1Tx 洗涤至少 3 次，每次洗涤 5 分钟。 直接移至 TRAP 染色（最佳方法）或在 PBS-0.1 Tx 中储存过夜。 对鳞片进行TRAP染色。取出PBS-0.1 Tx溶液并加入比色TRAP工作溶液（步骤5.2.1）以完全覆盖样品（即在1.5mL微量离心管中加入1mL）。 在室温下孵育1-2小时，在黑暗中摇晃。 除去染色溶液，用PBS-0.1 Tw洗涤至少3次，每次洗涤5分钟。 在室温下将样品后固定在 4% PFA 中 30 分钟，在黑暗中轻轻摇晃。 每步用PBS-0.1 Tw洗涤3次，每次5分钟，除去PFA溶液。注意：样品可以在4°C的黑暗中无限期地储存（在储存溶液中/安装在显微镜载玻片上）。 6. 染色鳞片的安装 通过向6g甘油中加入2.4g Mowiol 4-88晶体来制备封固剂（参见 材料表）。可以使用任何首选的安装介质。 加入 6 mL 去离子水，在磁力搅拌器上放置一个小时。 加入12mL的0.2M Tris（pH 8.5），并在约53°C下孵育至Mowiol晶体完全溶解。 通过在室温下以2000× g 离心20分钟来澄清溶液。 将解决方案传输到存储容器。封装介质可以在冰箱中保存约 12 个月。解冻后的 Mowiol 溶液可稳定保存长达 1 个月。 将鳞片安装在显微镜载玻片上，安装介质，用盖玻片盖住它们并在显微镜下观察它们。 7. 鳞片 的离体 培养 注：此步骤改编自 de Vrieze 等人 12。 在无菌环境中收获鳞片之前，准备成骨培养基和培养板。成骨培养基 （OCM）：在无菌离心管中，在标准细胞培养基（高葡萄糖、无谷氨酰胺、无酚红）中制备 15 mL OCM，终浓度为 1% 牛犊血清、1%（200 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽在 0.85% NaCl 中的溶液）、1% 抗生素/抗真菌溶液 （100x） 溶液、4 mM CaCl2、10 mM β-甘油磷酸盐、1 nM 丙酮酸钠和 1% 两性霉素 B（可选）（参见 材料表）。 将OCM倒入无菌试剂储液器中，并使用多通道移液管向96孔板的每个孔中加入100μL。 密封 96 孔板并储存板。OCM可以在冰箱中短期储存（过夜至1周），并在使用前保持在28°C。 进行鳞片收集和PBS清洗。使用无菌镊子/镊子收获鳞片，并将其存放在含有无菌PBS溶液的培养皿中。 执行板设置。使用无菌镊子将每个刻度从培养皿转移到96孔板上的每个孔中，用100μLOCM（加热至28°C）。 将所有鳞片转移到板上后，将板置于体视显微镜下。使用精细的无菌移液器吸头将每个刻度轻轻移动到孔底部，并使其远离孔的侧面，以避免在图像采集过程中出现光反射。注意：仅当执行实时成像时，才需要此步骤。 小心地将板转移到培养箱或实时成像系统（LIS，参见 材料表）（设定在28°C，5%CO2）中，在那里鳞片可以培养长达7天。 刷新 OCM（可选）。将存放在冰箱中的OCM加热至28°C。 小心地将 96 孔板转移到无菌环境中。使用多通道移液器，从每个孔中吸出 50 μL。为此，请将尖端压在墙壁上，不要将它们浸入底部，以避免吸气/移动/移除鳞片。针对不同条件使用新提示。 将 OCM 倒入无菌试剂储液槽中，并使用多通道移液器向每个孔中加入 60 μL OCM。 将板放在立体显微镜下，检查是否有放错位置的鳞片（离壁太近、漂浮或介质内的垂直位置）。如果需要，用细小的无菌移液器吸头重新定位它们。 将板放回培养箱/LIS中。注意：如果实验涉及昼夜节律 （CR），请勿刷新培养基，因为血清休克会影响生物钟。请注意，如果研究 CR 注意到光照条件也会重置时钟。 进行培养后鳞片染色和成像（可选）。培养 6 天后，固定它们并指导它们进行适当的染色，例如上面提到的 von Kossa 和 ALP。 或者，如果实验鱼有荧光标签，则将板放入实时成像系统中。注意： 如果使用实时成像系统，请确保将其设置为适合实验的温度和 CO2 水平。通常，在这项研究中，使用28°C和5%CO2 。选择适当的滤光片和成像时间点（此处使用2或4小时的间隔，足以跟踪成骨细胞迁移）和低放大倍率物镜（即4倍），以确保整个孔的均匀成像。这是因为秤往往会在井内移动，尤其是在介质变化期间。