De ex vivo bereiding van een doorsnede van het ruggenmerg voor de opname van de patchklem in motorneuronen met hele cellen tijdens stimulatie van het ruggenmerg
概要
Dit protocol beschrijft een methode met behulp van een patch-clamp om de elektrische reacties van motorneuronen op ruggenmergstimulatie (SCS) met een hoge spatiotemporele resolutie te bestuderen, wat onderzoekers kan helpen hun vaardigheden te verbeteren bij het scheiden van het ruggenmerg en het tegelijkertijd handhaven van de levensvatbaarheid van de cel.
Abstract
Ruggenmergstimulatie (SCS) kan de bewegingsfunctie effectief herstellen na een dwarslaesie (SCI). Omdat de motorneuronen de laatste eenheid zijn om sensomotorisch gedrag uit te voeren, kan het direct bestuderen van de elektrische reacties van motorneuronen met SCS ons helpen de onderliggende logica van spinale motorische modulatie te begrijpen. Om tegelijkertijd verschillende stimuluskenmerken en cellulaire reacties vast te leggen, is een patch-clamp een goede methode om de elektrofysiologische kenmerken op eencellige schaal te bestuderen. Er zijn echter nog steeds enkele complexe moeilijkheden om dit doel te bereiken, waaronder het handhaven van de levensvatbaarheid van de cel, het snel scheiden van het ruggenmerg van de benige structuur en het gebruik van de SCS om met succes actiepotentialen te induceren. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol met behulp van patch-clamp om de elektrische reacties van motorneuronen op SCS met een hoge spatiotemporele resolutie te bestuderen, wat onderzoekers kan helpen hun vaardigheden te verbeteren bij het scheiden van het ruggenmerg en tegelijkertijd de levensvatbaarheid van de cel te behouden om het elektrische mechanisme van SCS op motorneuron soepel te bestuderen en onnodig vallen en opstaan te voorkomen.
Introduction
Ruggenmergstimulatie (SCS) kan de bewegingsfunctie effectief herstellen na een dwarslaesie (SCI). Andreas Rowald et al. meldden dat SCS de bewegings- en rompfunctie van de onderste ledematen binnen één dag mogelijkmaakt1. Het onderzoeken van het biologische mechanisme van SCS voor locomotorisch herstel is een cruciaal en trending onderzoeksgebied voor het ontwikkelen van een preciezere SCS-strategie. Het team van Grégoire Courtine toonde bijvoorbeeld aan dat excitatoire Vsx2-interneuron en Hoxa10-neuronen in het ruggenmerg de belangrijkste neuronen zijn voor de respons op SCS, en dat celspecifieke neuromodulatie haalbaar is om het loopvermogen van ratten na SCI2 te herstellen. Er zijn echter maar weinig studies die zich richten op het elektrische mechanisme van SCS op eencellige schaal. Hoewel het algemeen bekend is dat de bovendrempelige gelijkstroomstimulus de actiepotentialen (AP’s) in het klassieke inktvisexperiment 3,4,5 kan opwekken, is het nog onduidelijk hoe de gepulseerde wisselende elektrische stimulatie, zoals SCS, de motorsignaalgeneratie beïnvloedt.
Gezien de complexiteit van intraspinale neurale circuits, is een geschikte selectie voor celpopulatie belangrijk voor het onderzoeken van het elektrische mechanisme van SCS. Hoewel SCS de motorische functie herstelt door de proprioceptieve route6 te activeren, zijn de motorneuronen de laatste eenheid om het motorcommando uit te voeren, afgeleid van de integratie van proprioceptie-informatie afferente input7. Daarom kan het rechtstreeks bestuderen van de elektrische kenmerken van motorneuronen met SCS ons helpen de onderliggende logica van spinale motormodulatie te begrijpen.
Zoals we weten, is patch-clamp de gouden standaardmethode voor cellulaire elektrofysiologische registratie met extreem hoge spatiotemporele resolutie8. Daarom beschrijft deze studie een methode met behulp van een patchklem om de elektrische reacties van motorneuronen op SCS te bestuderen. Vergeleken met de hersenpleisterklem9 is de ruggenmergklem moeilijker om de volgende redenen: (1) Het ruggenmerg wordt beschermd door het wervelkanaal met een klein volume, wat zeer fijne micromanipulatie en rigoureus ijskoud onderhoud vereist om een betere cellevensvatbaarheid te verkrijgen. (2) Omdat het ruggenmerg te slank is om op de snijplaat te worden vastgezet, moet het worden ondergedompeld in agarose met een laag smeltpunt en na stolling worden bijgesneden.
Daarom biedt deze methode technische details bij het ontleden van het ruggenmerg en het tegelijkertijd handhaven van de levensvatbaarheid van de cel, om het elektrische mechanisme van SCS op motorneuronen soepel te bestuderen en onnodige vallen en opstaan te voorkomen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De bewegingsinformatie die door SCS wordt gemoduleerd, wordt uiteindelijk geconvergeerd naar de motorneuronen. Daarom kan het nemen van de motorneuronen als onderzoeksdoel de onderzoeksopzet vereenvoudigen en het neuromodulatiemechanisme van SCS directer onthullen. Om tegelijkertijd verschillende stimuluskenmerken en cellulaire reacties vast te leggen, is een patch-clamp een goede methode om de elektrofysiologische kenmerken op eencellige schaal te bestuderen. Er zijn echter nog steeds enkele moeilijkheden, waaronder hoe…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd gefinancierd door de National Natural Science Foundation of China for Young Scholars (52207254 en 82301657) en het China Postdoctoral Science Fund (2022M711833).
Materials
| Adenosine 5’-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4034 | |
| CaCl2·2H2O | Sigma | C5080 | |
| Choline Chloride | Sigma | C7527 | |
| Cover slide tweezers | VETUS | 36A-SA | Clip a slice |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Fine scissors | RWD Life Science | S12006-10 | Cut the diaphragm |
| Fluorescence Light Source | Olympus | U-HGLGPS | |
| Fluoro-Gold | Fluorochrome | Fluorochrome | Label the motor neuron |
| Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma | G8877 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| infrared CCD camera | Dage-MTI | IR-1000E | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| K-gluconate | Sigma | P1847 | |
| Low melting point agarose | Sigma | A9414 | |
| MgSO4·7H2O | Sigma | M2773 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-200 | |
| Micropipette puller | Sutter instrument | P1000 | |
| Micro-scissors | Jinzhong | wa1020 | Laminectomy |
| Microscope for anatomy | Olympus | SZX10 | |
| Microscope for ecletrophysiology | Olympus | BX51WI | |
| Micro-toothed tweezers | RWD Life Science | F11008-09 | Lift the cut vertebral body |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | |
| NaHCO3 | Sigma | V900182 | |
| Na-Phosphocreatine | Sigma | P7936 | |
| Objective lens for ecletrophysiology | Olympus | LUMPLFLN60XW | working distance 2 mm |
| Osmometer | Advanced | FISKE 210 | |
| Patch-clamp amplifier | Axon | Multiclamp 700B | |
| Patch-clamp digitizer | Axon | Digidata 1550B | |
| pH meter | Mettler Toledo | FE28 | |
| Slice Anchor | Multichannel system | SHD-27H | |
| Spinal cord stimulatior | PINS | T901 | |
| Toothed tweezer | RWD Life Science | F13030-10 | Lift the xiphoid |
| Vibratome | Leica | VT1200S | |
| Wide band ultraviolet excitation filter | Olympus | U-MF2 |
参考文献
- Rowald, A., et al. Activity-dependent spinal cord neuromodulation rapidly restores trunk and leg motor functions after complete paralysis. Nature Medicine. 28 (2), 260-271 (2022).
- Kathe, C., et al. The neurons that restore walking after paralysis. Nature. 611 (7936), 540-547 (2022).
- Smith, S. J., Buchanan, J., Osses, L. R., Charlton, M. P., Augustine, G. J. The spatial distribution of calcium signals in squid presynaptic terminals. The Journal of Physiology. 472, 573-593 (1993).
- Augustine, G. J. Regulation of transmitter release at the squid giant synapse by presynaptic delayed rectifier potassium current. The Journal of Physiology. 431, 343-364 (1990).
- Llinás, R., McGuinness, T. L., Leonard, C. S., Sugimori, M., Greengard, P. Intraterminal injection of synapsin I or calcium/calmodulin-dependent protein kinase II alters neurotransmitter release at the squid giant synapse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (9), 3035-3039 (1985).
- Formento, E., et al. Electrical spinal cord stimulation must preserve proprioception to enable locomotion in humans with spinal cord injury. Nature Neuroscience. 21 (12), 1728-1741 (2018).
- Hari, K., et al. GABA facilitates spike propagation through branch points of sensory axons in the spinal cord. Nature Neuroscience. 25 (10), 1288-1299 (2022).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review Of Physiology. 46, 455-472 (1984).
- Leroy, F., Lamotte d’Incamps, B. The preparation of oblique spinal cord slices for ventral root stimulation. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (116), e54525 (2016).
- Sharples, S. A., Miles, G. B. Maturation of persistent and hyperpolarization-activated inward currents shapes the differential activation of motoneuron subtypes during postnatal development. Elife. 10, e71385 (2021).
- Bhumbra, G. S., Beato, M. Recurrent excitation between motoneurones propagates across segments and is purely glutamatergic. PLoS Biology. 16 (3), e2003586 (2018).
- Leroy, F., Lamotte d’Incamps, B., Imhoff-Manuel, R. D., Zytnicki, D. Early intrinsic hyperexcitability does not contribute to motoneuron degeneration in amyotrophic lateral sclerosis. Elife. 3, 04046 (2014).
- Tahir, R. A., Pabaney, A. H. Therapeutic hypothermia and ischemic stroke: A literature review. Surgical Neurology International. 7, S381-S386 (2016).
- Lu, Y., et al. Management of intractable pain in patients with implanted spinal cord stimulation devices during the COVID-19 pandemic using a remote and wireless programming system. Frontiers in Neuroscience. 14, 594696 (2020).
- Yao, Q., et al. Wireless epidural electrical stimulation in combination with serotonin agonists improves intraspinal metabolism in spinal cord injury rats. Neuromodulation. 24 (3), 416-426 (2021).
- Arlotti, M., Rahman, A., Minhas, P., Bikson, M. Axon terminal polarization induced by weak uniform dc electric fields: a modeling study. 2012 Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. , 4575-4578 (2012).
- Espino, C. M., et al. Na(V)1.1 is essential for proprioceptive signaling and motor behaviors. Elife. 11, e79917 (2022).
- Romer, S. H., Deardorff, A. S., Fyffe, R. E. W. A molecular rheostat: Kv2.1 currents maintain or suppress repetitive firing in motoneurons. The Journal of Physiology. 597 (14), 3769-3786 (2019).
- Yao, X., et al. Structures of the R-type human Ca(v)2.3 channel reveal conformational crosstalk of the intracellular segments. Nature Communications. 13 (1), 7358 (2022).
- Bandres, M. F., Gomes, J., McPherson, J. G. Spontaneous multimodal neural transmission suggests that adult spinal networks maintain an intrinsic state of readiness to execute sensorimotor behaviors. Journal Of Neuroscience. 41 (38), 7978-7990 (2021).
- Manuel, M., Heckman, C. J. Simultaneous intracellular recording of a lumbar motoneuron and the force produced by its motor unit in the adult mouse in vivo. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (70), e4312 (2012).
- Luo, X., Wang, S., Rutkove, S. B., Sanchez, B. Nonhomogeneous volume conduction effects affecting needle electromyography: an analytical and simulation study. Physiological Measurement. 42 (11), (2021).
- Barra, B., et al. Epidural electrical stimulation of the cervical dorsal roots restores voluntary upper limb control in paralyzed monkeys. Nature Neuroscience. 25 (7), 924-934 (2022).
- Powell, M. P., et al. Epidural stimulation of the cervical spinal cord for post-stroke upper-limb paresis. Nature Medicine. 29 (3), 689-699 (2023).
- Wenger, N., et al. Spatiotemporal neuromodulation therapies engaging muscle synergies improve motor control after spinal cord injury. Nature Medicine. 22 (2), 138-145 (2016).
- Özyurt, M. G., Ojeda-Alonso, J., Beato, M., Nascimento, F. In vitro longitudinal lumbar spinal cord preparations to study sensory and recurrent motor microcircuits of juvenile mice. Journal of Neurophysiology. 128 (3), 711-726 (2022).
- Moraud, E. M., et al. Mechanisms underlying the neuromodulation of spinal circuits for correcting gait and balance deficits after spinal cord injury. Neuron. 89 (4), 814-828 (2016).
- Capogrosso, M., et al. A computational model for epidural electrical stimulation of spinal sensorimotor circuits. Journal of Neuroscience. 33 (49), 19326-19340 (2013).
