Mensuração do Consumo de O₂ em Drosophila melanogaster Utilizando Microrrespirometria Coulométrica

A capacidade de medir a taxa metabólica é crucial para uma compreensão completa de um organismo em seu contexto ambiental. Por exemplo, é necessário medir a taxa metabólica para entender seu papel no tempo de vida¹, o papel da dieta no metabolismo² ou o limiar para o estresse hipóxico³.

Existem duas abordagens gerais para medir a taxa metabólica⁴. A calorimetria direta mede o gasto energético diretamente medindo a produção de calor. A calorimetria indireta mede a produção de energia por outros meios, muitas vezes por meio da medição respirométrica do consumo de O 2 (V_O2), produção de CO₂ ou ambos. Embora a calorimetria direta tenha sido aplicada a pequenos ectotérmicos, incluindo Drosophila melanogaster⁵, a respirometria é tecnicamente mais simples e mais comumente usada.

Várias formas de respirometria têm sido usadas com sucesso para medir a taxa metabólica em D. melanogaster selvagem e mutante e têm fornecido informações sobre os efeitos metabólicos da temperatura⁶, ambiente social 3, dieta ^{3,7 e distúrbios} do neurodesenvolvimento⁸. Estes dividem-se em duas classes, que variam consideravelmente em custo e complexidade. A manometria é a mais simples e barata ^9,10, na qual as moscas são colocadas em uma câmara selada que contém um absorvente de CO₂ e que é conectada através de um capilar fino a um reservatório de fluido. À medida que o O 2 é consumido e o CO₂ absorvido, a pressão na câmara diminui e o fluido é atraído para o capilar. O volume preenchido por líquido do capilar é, portanto, proporcional ao V_O2. Versões mais elaboradas, que compensam a força exercida pelo fluido no capilar, também têm sido utilizadas em D. melanogaster¹. A manometria tem as vantagens de ser simples e barata, mas, por ser sensível à pressão, requer condições ambientais constantes. Além disso, como o O 2 consumido não é substituído, a pressão parcial de O₂ (P_O2) diminui gradualmente dentro das câmaras.

A respirometria usando análise de gases também é regularmente usada para D. melanogaster. Neste caso, os gases são amostrados em intervalos regulares a partir de câmaras seladas contendo moscas e enviados para um analisador infravermelho ^2,6,11. Esse tipo de aparelho tem as vantagens de estar disponível comercialmente, ser menos sensível às condições ambientais e os gases serem refrescados durante a amostragem para que o P_O2 permaneça estável. No entanto, o equipamento pode ser caro e complexo de operar.

Um microrrespirômetro coulométrico¹² recentemente desenvolvido fornece uma alternativa barata, sensível e estável aos sistemas existentes. Na prática, um organismo é colocado em uma câmara hermética onde consome O 2 e o CO₂ exalado é removido por um material absorvente, resultando em uma diminuição líquida na pressão da câmara. Quando a pressão interna diminui para um limiar pré-estabelecido (ON-threshold), a corrente é passada através de um gerador eletrolítico O₂, retornando a pressão para um segundo limiar (OFF-threshold) parando a eletrólise. A transferência de carga através do gerador de O 2 é diretamente proporcional à quantidade de O 2 necessária para repressurizar a câmara e, portanto, pode ser usada para medir o O₂ consumido pelo organismo⁴. O método é altamente sensível, mede V O2 com precisão, e a reposição regular de O₂ pode manter P_O2 em um nível quase constante por horas ou dias.

O microrrespirômetro coulométrico utilizado neste estudo emprega um sensor eletrônico multimodal (pressão, temperatura e umidade). O sensor é operado por um microcontrolador que detecta pequenas mudanças de pressão e ativa a geração de O₂ quando um limiar de baixa pressão é atingido¹². Este aparelho é montado a partir de peças de prateleira, pode ser usado com uma grande variedade de câmaras e ambientes experimentais, e tem sido empregado com sucesso para examinar os efeitos da massa corporal e temperatura sobre o besouro Tenebrio molitor. No presente estudo, o microrrespirômetro foi adaptado para medir o consumo de O₂ em D. melanogaster, que possui aproximadamente 1% da massa de T. molitor. A sensibilidade do aparelho foi aumentada pela redução do limiar de ativação da geração de O₂ , e a estabilidade ambiental foi melhorada pela realização de experimentos em banho-maria com temperatura controlada e pela manutenção da umidade no interior das câmaras em ou perto de 100%.

A proteína CASK (Calmodulin-dependent Serine Protein Kinase), parte da família das guanilato quinases associadas à membrana (MAGUK), é um arcabouço molecular em diferentes complexos multiproteicos, e mutações no CASK estão associadas a distúrbios do neurodesenvolvimento em humanos e em D. melanogaster^13,14. Um mutante viável de D. melanogaster, CASK^Δ18, interrompe a atividade de neurônios dopaminérgicos 15 e reduz os níveis de atividade em mais de 50% em comparação com controles congênicos^14,16. Devido aos níveis reduzidos de atividade dos mutantes CASK e ao papel das catecolaminas na regulação do metabolismo¹⁷, levantamos a hipótese de que sua taxa metabólica padrão e, portanto, o consumo de O₂, seriam drasticamente reduzidos em comparação com os controles.

O consumo de O₂ foi medido em CASK^Δ18 e seus congêneres selvagens, w(ex33). Grupos de moscas foram colocados em câmaras de respirometria, o consumo de O 2 foi medido, o consumo de O₂ foi calculado e expresso em uma base específica de massa e por mosca. O aparelho registrou V_O2 em moscas selvagens que foi consistente com estudos anteriores, e poderia diferenciar entre o consumo por mosca O₂ de moscas selvagens e mutantes CARK.