バイオフィルム感染と不可視創傷のブタモデル

すべての動物実験は、Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC)#21147によって承認されたプロトコルに従って実施されました。この研究は、インディアナ大学の実験動物リソースセンター(LARC)で実施されました。このプロトコルでは、雌の家畜白豚(70〜80ポンド)を使用しました。 1.動物の順応 豚が施設に到着したら、順応と社会的交流のために、少なくとも3日間、同じ部屋に動物を個別に収容します。 豚にバランスの取れた食事を与えます。体重に基づいて給餌量を決定し、メーカーの推奨事項に従ってください。 麻酔中の吐き気、嘔吐、胃液の誤嚥を防ぐために、処置の前に動物を6〜12時間絶食させてください。 2. 手術室の設営 麻酔器を準備し、再呼吸回路の準備ができていることを確認します。 以下に説明するように、手術用の部屋を配置します(図1A)。処置台を滅菌ドレープで覆い、その下に循環水ブランケットを敷いて体温調節を助けます。 誘導用品と手術準備資料をテーブルに設置します。バーナー装置とコントロールボックスを備えたテーブルを設置します。イメージング機器をセットアップし、電源が入っていることを確認します。 3.豚の鎮静 1 mL / 50ポンドの用量でTKX(テラゾール4.4 mg / kg、ケタミン2.2 mg / kg、キシラジン2.2 mg / kg)の筋肉内注射で豚を鎮静させます。.処置室で、マスク を介して 送達された1%〜3%のイソフルランで豚を維持します。 IACUCプロトコルに従って(術前の)鎮痛薬を豚に投与します。いくつかの例は次のとおりです:ブプレノルフィン0.3 mg / mL、0.01-0.05 mg / kg IM;カルプロフェン 50 mg/mL、4 mg/kg IM または SQ;フェンタニル経皮吸収型100mcg / hを耳の耳介に置きます。ガバペンチン300mgカプセル、3-10 mg / kg PO。注:すべての火傷および生検手順では、手術の前日にガバペンチンを1回投与し、処置当日にカルプロフェンを1回投与します。主な燃焼手順では、フェンタニルパッチを配置し、手術の準備中にブプレノルフィンを1回全量投与します。 4.麻酔の導入 2%クロルヘキシジンスクラブとアルコールを交互に少なくとも3回使用して耳を消毒します。A 22-18 G 1 in 静脈カテーテルを耳辺縁静脈に挿入し、血流を確認します。カテーテルを生理食塩水で洗い流し、サージカルテープでカテーテルを固定します(図1B)。 マスク を介して 麻酔を吸入して筋肉の弛緩が達成されたら、適切なサイズの気管内チューブ(7〜9 mm)で豚を挿管します。.顎の緊張の喪失と眼瞼反射が観察されることで、筋肉の弛緩を確認します。チューブを開き、空気の注射器を使用してカフの漏れをテストします。喉頭鏡30の助けを借りてチューブを挿入します。 カフを膨らませ、適切な配置が確認されたらチューブを固定します。ブタを再呼吸回路に接続します。注意: チューブは鼻の上で所定の位置に結び付けられ、ロールガーゼを使用して固定されます。胸部の聴診は聴診器で行われ、チューブの適切な配置を確認します。注意: 麻酔中は、体位無気肺を防ぐために、圧力圧力計が20 mm / Hgに達するまで、ポップオフバルブを閉じ、再呼吸バッグを押し下げることにより、5〜10分ごとに空気が供給されます。 動物と麻酔の深さを監視します。ブタをマルチパラメータモニターに接続します。モニターは、酸素飽和度(SpO 2)、脈拍数、終潮二酸化炭素(EtCO2)、呼吸数、および温度を継続的に読み取ります。手順全体を通して10分ごとにバイタルを記録します。 創傷を開始する前に、後ろ足のつま先をつまんで痛みの反射をテストして、麻酔の深さを評価します。注意: 必要に応じて、麻酔薬気化器を調整して追加の麻酔を投与するか、数分待ちます。手術中は、疼痛反射と眼瞼反射を定期的にチェックしてください。 5.火傷傷のための動物の準備 豚を麻酔器から外し、処置台に移します。豚を胸骨横臥位に置き、接続されているすべてのラインとチューブを固定してください(図1C)。 豚を麻酔器に再接続し、手順が終了するまで、O2 を0.8〜1.5 L / minに、イソフルランを1%〜3%に維持します。 8〜10 mL / kg / hの点滴速度で豚にIV輸液(LRS)を投与します。ステップ4.3のように麻酔を監視します。 6.皮膚の火傷部位の防腐剤の準備とマーキング 以下に説明するように、毛を剃って脱毛クリームを塗布して、傷口を準備します(図2)。電気バリカンを使用して、脊柱から両側の腋窩まで幅約25cmの領域で豚の背部を剃ります。 刈り取った部分に脱毛クリームを塗り、3〜7分間放置します。清潔な吸収性タオルを使用して、髪と一緒にクリームを取り除きます。 焼却部位の準備2%クロルヘキシジンスクラブと70%イソプロピルアルコールを交互に約5分間、少なくとも3回こすります。滅菌手袋を着用した担当者が、スクラブをブルズアイパターン(中央から始めてらせん状に外側に移動する)で塗布されていることを確認します。 滅菌熱傷テンプレートと外科用皮膚マーカーを使用して創傷部位に印を付けます(図2B)。背部に6〜8個の傷(2インチx 2インチ)を対称的にマークします。 汚染を減らすために、マークされた部位の周囲を滅菌ドレープで覆います(図2C)。 7.火傷の傷の手順 金属製のスタイラスに接続された2インチx 2インチのステンレス鋼ブロック(重量:352 g)、電子マイクロスタット、電子スケール(総重量:1,714 g; 図3)。バーナーを希望の温度に設定します。全層創傷の目標温度を150°Cに調整します(図3A)。これを行うには、コントロールユニットの設定値(SP)を150°Cに調整します。 下限設定値を145°Cに、上限設定値を155°Cに設定します(図1D)。 火傷装置に接続された加熱されたステンレス鋼ブロックを使用し、それらを60秒間皮膚に置くことにより、2インチx 2インチの全層火傷傷を作成します(図3B、C)。火傷の適用中は、電子スケールを使用して、バーナーによって均一な圧力が加えられていることを確認します。 8.火傷の診断とイメージング デジタル写真デジタル一眼レフカメラとエレクトロフォーカスショートバックフォーカス(EFS)、17-55mm超音波広角レンズ、懐中電灯を使用して傷を画像化します。 豚の識別番号、時刻、日付が記載されたプラカードを含め、豚全体のデジタル写真を撮ります。次に、豚のID、傷のIDと時点、および定規が記載されたプラカードを示す各傷の画像を個別に撮影します。 創傷面積を、56日目までの収集の各時点での元の創傷サイズのパーセンテージとして計算します。注:この研究では、各時点(d0、d7、d14、d28、およびd56)で、d0の元の創傷面積のパーセンテージとして創傷面積が計算されました。 レーザースペックルイメージング(LSI)レーザースペックルイメージングでは、レーザースペックルコントラスト分析(LASCA)技術に基づく血液灌流イメージャーを使用して、創傷微小血管灌流をリアルタイムで評価します。 1回の録画ですべての傷の画像を撮影します。レーザーカメラから創傷までの作動距離の測定値を調整して、各創傷のイメージングで一致するようにします(図4A)。 10〜15秒のスパンで撮影された一連の画像によって灌流を記録します。傷口が撮影されると、録画は自動的に一時停止し、その後の傷口に合わせてカメラが調整されると、録画が再開されます。記録が一時停止するたびに、傷を識別するためのマーカーが追加されます。 経表皮水分損失(TEWL)標準ユニット、TEWLプローブ、およびソフトウェアを使用して、各創傷のTEWLを測定します(図4B)。創傷ごとに、創傷組織と接触するプローブ先端に清潔なプローブカバーを置きます。 プローブを皮膚に優しく均等に置き、ユニットの スタート ボタンを押して読み取りを開始します。 各傷口を5回、最初に中央で、次に各角で測定します。次に、すべての測定値をスプレッドシートにエクスポートします(図4B)。 高調波超音波(HUSD)正中線(脊柱)から正中線(脊柱)から正常な皮膚が再び正常な皮膚があるブタの外側に向かって超音波(US)プローブで創傷をスキャンして、HUSDマッピングを実行します。超音波装置を使用して、Bモードモードと組織エラストグラフィモードの両方で、各創傷についてこのスキャンパターンに従います(図4C)。Bモードスキャンの場合は、滅菌超音波ジェルを創傷部位に塗布し、ML-615高解像度プローブに塗布します。各録音に創傷識別ラベルの注釈を付けます。記録を開始し、反対側の正常な皮膚に到達するまで、プローブを正中線から創傷までゆっくりと動かします。注意: スキャンが終了すると、記録は保存され、分析のためにマシンからエクスポートされます。 エラストグラフィの場合は、 Elesto ボタンを押して超音波装置をエラストモードに切り替えます。Bモードスキャンと同じ方法で創傷を再度スキャンし、プローブの圧力が均一に保たれ、エラストグラフィカラーインジケーター(緑色のバー)が記録中ずっと見えるようにします。メモ: 適切な圧力は、正しい接触が行われていると緑色で表示される記録のスケールバーによって決定できます(図4D)。 各創傷がBモードとエラストモードの両方で画像化された後(創傷ごとに2つの記録)アノテーションを変更します。ソフトウェアのコメントを変更して、次の傷の情報を含め、後続の傷についても同じ手順を繰り返します。 9.包帯と包帯 火傷の傷口を透明フィルムドレッシングまたはテストドレッシングで個別に覆います(図5A、B)。大きな透明フィルムドレッシングを創傷領域全体に置きます(図5C)。 豚の胴体全体にロールガーゼの2層目をゆるく塗り、傷口から出る液体の滲出液を吸収します。豚を横から少し仰向けに前後に転がして、包帯を豚に巻き付けます。 ガーゼを柔軟な弾性包帯の層でゆるく覆います(図5D)。包帯をきつく貼りすぎると呼吸が制限され、腹部に圧力がかかり、直腸脱やさまざまな合併症を引き起こす可能性があるため、包帯がきつすぎないようにしてください。注意: 弾性包帯は伸縮性があり、適用中に簡単に締めすぎる可能性があります。ロールから引き離し、前のラップの端の上に置くと、締めすぎを防ぐのに役立ちます。 弾性包帯を最終層4で弾性テープで覆います(図4E)。繰り返しになりますが、塗布がきつすぎないようにしますが、処置後に豚が動き回るときにドレッシングが滑り落ちないように、ドレッシングが上端と下端で固定されていることを確認してください。 10.動物の回復と術後のケア 回復創傷、画像診断、包帯の完了時に麻酔ガスを中止します。.豚を少なくとも5分間酸素にとどめます。 主囲いに戻った後、豚を輸送/リフトテーブルからケージ内のフォーム回収マットに移動します。自動給水器を上げ、回復中の豚の怪我を防ぐためにjフィーダーを取り外します。 低体温症がある場合は、豚を毛布(暖かい空気の毛布を含む)で覆います。10〜15分ごとに、体温、脈拍、呼吸数、SpO2 などのバイタルを監視および記録します。 豚が胸骨臥位を独立して維持できるようになるまで、豚を継続的に監視します。.豚が完全に回復したら、乳首給水器を下げてから、豚にも餌を与えることができます。 疼痛評価修正されたグラスゴー疼痛スコアリングフォームを使用して、術後の疼痛評価を実行します。術後最初の3〜4日間は、少なくとも12時間ごとにラボまたはLARCスタッフが疼痛評価を完了してください。疼痛スコアリングの頻度は、主治医によって決定されます。動物のスコアが5を超える場合は、レスキュー鎮痛薬(ブプレノルフィンまたはヒドロモルフォン)を投与します。. 処置前にブプレノルフィン0.01〜0.05 mg / kg IMの用量を投与し、8〜12時間後に2回目の投与を行うことで鎮痛を提供します。. 火傷の傷の前に、耳の耳介にフェンタニルパッチ(100 mcg / h)を置きます。. カルプロフェン 4 mg/kg IM または SQ 前処置を注射し、その後、1 日 1 回 IM、SQ、または PO を 2 日間、または LARC 獣医師の指示に従って注射します。 ガバペンチン3〜10 mg / kgを経口投与し、処置の前日、処置の朝、処置の翌日の夕方、その後3〜5日間12時間ごとに投与します。. ダイエット豚が回復していることを確認し、1日2回、体重に応じた飼料に応じて水と餌を自由に使えるようにします。 食品(新鮮な果物や野菜、冷凍果物、マシュマロ、ヨーグルト、プリンなど)を提供し、食欲減退が観察された場合はこれらを使用して食事を誘惑します。 ドレッシング交換包帯が汚れた場合、または治療戦略に対応するために、少なくとも週に1回、またはそれ以上の頻度で包帯を交換してください。 麻酔下での画像撮影後に包帯を交換するか、TKXのみで豚を鎮静させてドレッシングを交換します。 包帯を交換するには、まず、リスター包帯ハサミまたは外傷ばさみを使用して、包帯の外側が傷口に触れないように注意しながら、汚れた包帯を慎重に取り除きます。 必要に応じて、清潔なガーゼに0.9%NaClを使用して傷口の周囲を清掃し、その領域を穏やかに乾かします。セクション9で概説されている包帯の手順に従ってください。注:実験的な包帯を塗布する場合は、透明フィルムの被覆材で創傷を覆う前に塗布することができます。 撮像周波数研究中のさまざまな時点で画像(デジタル写真、LSI、TEWL、およびHUSD)を取得します。接種後-3日目(火傷)、0日目(接種)、および7日目、14日目、28日目、35日目、および56日目の画像データを収集します。 11.バイオフィルムの調製と接種 接種剤の調製緑膿菌(PA01)のグリセロールフリーザーストックからスタータープレートを調製し、細菌の純粋培養を行います。緑膿菌培養液を低塩Luria-Bertani寒天培地(LBA)で増殖させ、37°Cで一晩インキュベートします。 翌日、5 mLの低塩Luria-Bertaniブロス(LBB)に 緑膿菌 のコロニーを1つ接種し、200rpmで振とうしながら37°Cで一晩インキュベートします。 対数期細胞を得るには、200 μLの一晩培養液を5 mLのLBBに接種し、シェーカー内で200 rpm、37°C、2.5時間インキュベートします。 分光光度計を用いて600nm(OD600)の光学濃度を測定する。900 μL の滅菌 LBB で培養した 100 μL を使用して、1 x 10-9 までの段階希釈液を調製します。注:希釈していないサンプルから開始し、1 x 10 7 CFU/mLで終了しました。1 x 107 希釈で可算コロニーが得られたため、この希釈を終了希釈と見なしました。 各希釈液100 μLをLBAに広げ、37°Cで一晩インキュベートします。 標準的な微生物学的プロトコルに従って、コロニー数に可算コロニー(30〜300)を示す希釈液を使用し、コロニー形成単位(CFU)を取得します。 創傷の接種一晩培養した200μLを5mLのLBブロスに接種し、シェーカーで37°Cで2.5時間インキュベートします。 600nm(OD600)で日培養の光学濃度を測定します。PA01 接種には、3 x 10 8 CFU/mL を使用します (1 x 108 CFU/mL の PA01 を 1 創傷あたり 250 μL 接種します)。接種物をバイオハザード容器に入れて動物施設に輸送します。 火傷後3日目にピペットを使用して露出した創傷の表面に接種物を分散させ、使い捨てのスプレッダーを使用して均等に広げます(図6)。包帯を巻く前に、傷口を約15分間開いたままにします。注:すべての外科的処置、接種、組織生検、画像診断、および包帯は、セクション3および4と同様に全身麻酔下で行われます。 感染の確定確認注:接種後に創傷が正常に感染したことを確認するために、いくつかのアプローチが利用され、創傷サンプルが正常な皮膚から収集されたサンプルと比較されます。以下はその一例です。異なる時点で収集されたサンプルの病理学ベースの分析では、コロニー形成単位の数を使用して感染を推定します(CFU; 図7E、F)。パンチ生検で6mmの創傷組織を採取します。空の5 mL丸底チューブにラベルを貼り、計量します。サンプルをチューブに移し、サンプルと一緒にチューブの重量を量ります。 滅菌表面にメスで組織をさいの目に切る。BSL2フードですべての手順を実行します。注:組織が簡単に均質化されるようにするには、サイズを非常に小さくする必要があります(ただし、0.5 mm以上) サンプルをチューブに入れ、PBSを1mL添加します。硬組織粉砕プローブを使用して組織を混合し、粉砕します。 ホモジネートを段階希釈(1 x 10-5に希釈)し、各希釈液50 μLを選択的(シュードモナス単離寒天培地、PIA)および非選択的(LBA)培地にプレートします。 すべての希釈液を好気性条件下で37°Cで18〜24時間インキュベートします。適切な照明条件でプレートを画像化します。 30〜300コロニーのプレートを選択し、どのプレートもその濃度に達していない場合は、希釈されていないプレートを使用します。ImageJ を使用してコロニー数をカウントし、平均値に最終希釈係数を掛けてプレートあたりの CFU を計算します。 走査型電子顕微鏡(SEM)を使用して、接種後7日目およびその他の時点から収集したサンプルから画像を取得し、細菌バイオフィルムの存在を確認します(図7G)。注:接種後7日目は、バイオフィルム感染が確立され、火傷痂皮の軟化が始まる日であり、米国の波が浸透し、より深い組織の視覚化が可能になるため、選択されました。 図4では、米国の熱傷の3日目の画像を確認すると、米国の波が深部組織に伝わるのを防ぐ厚い革のような痂皮が示されています。 創傷生検の切片を緑 膿菌 に対する特異的抗体で染色し、以前の出版物13 (図7H)に示されているように、特定の細菌の存在を確認します。 Sinha et al.31 で発表されている次世代シーケンシング (NGS) を実行します。感染した創傷と、接種後 7 日目から研究終了までのさまざまな時点で収集された正常な非感染皮膚サンプルからの細菌 16srRNA を定量します。 12.生検収集 接種後7日目、14日目、28日目、および56日目の画像診断後の分析のために組織生検を収集します。治癒過程への干渉を最小限に抑えるために、各創傷から生検を1回だけ収集します。注:すべての外科的処置、接種、組織生検、画像診断、および包帯は、セクション3および4と同様に全身麻酔下で行われます。0.5%ブピバカインで傷の周囲に浸潤します。.サイズ10のブレードを備えた使い捨てメスを使用して、傷口の一方の端からもう一方の端まで3〜4 mm幅のストリップを切り取り、両側に正常な皮膚の小さなマージンを保ちます。固定のために4%緩衝ホルマリンで満たされたラベル付きコニカルチューブにストリップを入れます。注:初期の時点イメージングおよび生検手順では、手術の準備中に全用量のブプレノルフィンが投与されます。後期の生検手順では、手術の準備中にブプレノルフィンの半分の用量が投与されます。すべての火傷と生検の手順の後、ガバペンチンは、主治医のアドバイスに従って最大7日間BIDを投与されます。カルプロフェンは、術後数日間、または主治医のアドバイスに従って投与されます。 創傷から6mmのパンチ生検を切り取ります(創傷床または創傷縁のいずれかから)。正常な皮膚の一部や創傷床を含む創傷縁から収集し、さまざまなタイプの分析を行います。 滅菌した鉗子と解剖ハサミを使用してサンプルを取り除きます。生検サンプルを適切なチューブまたはカセットに入れて、処理と分析を行います。 CFU、SEM、RNA、およびFPPEの場合、サンプルは適切なバッファーとともにチューブに保存してください。例えば、レーザー捕捉顕微鏡(LCM)や免疫組織化学(IHC)のために、サンプルをカセットに入れてOCTに入れることができます。 検体が採取された後、滅菌ガーゼで創傷をそっと押して止血します。非癒着性包帯で傷口を覆い、セクション9のように包帯を巻く。 13.安楽死と組織採取 安楽死の日にTKXで豚を鎮静させ、イソフルランで麻酔します。セクション3で概説されている手順に従って、辺縁耳静脈に静脈内カテーテルを配置します。セクション4の手順に従って豚を挿管します。 豚に麻酔をかけたら包帯を外し、傷口の周りをきれいにします。 完全なデジタル写真、LSI、TEWL、およびHUSDイメージング。セクション12で概説されている手順に従って、創傷と正常な皮膚からサンプルを収集します。 必要なサンプルがすべて採取されたら、市販の安楽死溶液(ペントバルビタールナトリウム)の静脈内注射 により 、麻酔下で豚を人道的に安楽死させます。聴診器を使用して聴診を行い、心拍の停止と自発呼吸を確認します。 SOM IACUCの要求に応じて、メスを使用して気胸を誘発することにより、安楽死の二次的な方法を実行します。豚の死骸を樽に移し、冷凍庫に運んで焼却のために拾います。