생물막 감염 및 보이지 않는 상처의 돼지 모델
概要
항생제에 내성이 있는 만성 상처는 의료 시스템에 큰 위협이 됩니다. 생물막 감염은 완고하고 적대적이며 기능적 상처 봉합 부족을 유발할 수 있습니다. 우리는 생물막에 감염된 전층 만성 상처의 임상적으로 관련된 돼지 모델을 보고합니다. 이 모델은 기계론적 연구뿐만 아니라 중재 테스트에도 강력합니다.
Abstract
생물막 감염은 상처 만성의 주요 원인입니다. 임상적으로 관련된 실험적 상처 생물막 감염을 확립하려면 숙주 면역 체계의 개입이 필요합니다. 이러한 임상적으로 관련된 생물막이 형성되는 동안 숙주와 병원체의 반복적인 변화는 생체 내 에서만 발생할 수 있습니다. 돼지 상처 모델은 강력한 전임상 모델로서의 장점을 인정받고 있습니다. 상처 생물막을 연구하기 위한 몇 가지 보고된 접근 방식이 있습니다. in vitro 및 ex vivo 시스템은 숙주 면역 반응 측면에서 결핍되어 있습니다. 단기간의 생체 내 연구는 급성 반응을 포함하며, 따라서 임상적으로 발생하는 것으로 알려진 바와 같이 생물막 성숙을 허용하지 않습니다. 최초의 장기 돼지 상처 생물막 연구는 2014년에 보고되었습니다. 이 연구는 생물막에 감염된 상처가 평탄도법에 의해 결정된 대로 봉합될 수 있지만 영향을 받은 부위의 피부 장벽 기능이 회복되지 않을 수 있음을 인식했습니다. 나중에, 이 관찰은 임상적으로 검증되었다. 이렇게 해서 기능적 상처 봉합술의 개념이 탄생했습니다. 봉합된 상처는 피부 장벽 기능이 결핍된 상처로 볼 수 있습니다. 이 연구에서 우리는 임상적으로 관련성이 있고 중개 가치가 있는 생물막 감염 중증 화상 손상의 장기 돼지 모델을 재현하는 데 필요한 방법론적 세부 사항을 보고하고자 합니다. 이 프로토콜은 녹농균(P. aeruginosa , PA01)을 사용하여 8주간의 상처 생물막 감염을 확립하는 방법에 대한 자세한 지침을 제공합니다. 8개의 전신 화상 상처가 국내 백돼지의 등쪽에 대칭으로 생성되었으며, 화상 후 3일째에 (PA01)을 접종했습니다. 그 후, 레이저 스페클 이미징(LSI), 고해상도 초음파(HUSD) 및 경피 수분 손실(TEWL)을 사용하여 서로 다른 시점에서 상처 치유에 대한 비침습적 평가를 수행했습니다. 접종된 화상 상처는 4겹 드레싱으로 덮었습니다. 접종 후 7일째에 SEM에 의해 구조적으로 확립되고 확인된 생물막은 기능적 상처 봉합을 손상시켰습니다. 이러한 불리한 결과는 적절한 개입에 따라 반전될 수 있습니다.
Introduction
생물막 감염은 화상과 만성 상처를 복잡하게 만들고 만성 1,2,3,4,5를 유발한다. 미생물학에서 생물막 메커니즘은 주로 미생물 1,6에 중점을 두고 연구됩니다. 이 학문에서 배운 교훈은 생물 과학 견지에서 가장 중요하 그러나 임상으로 관련된 병원성 biofilms 6,7,8에 반드시 적용 가능하지 않을지도 모른다. 임상적으로 관련된 생물막 구조 응집체에는 미생물 및 숙주 인자 8,9,10이 포함되어야 합니다. 이러한 미세환경은 숙주-미생물 반복적 상호작용을 포함할 수 있으며, 이는 임상적으로 관련된 생물막 개발에 매우 중요합니다 7,8. 이러한 과정에서 면역 세포와 혈액 매개 인자의 참여가 중요합니다11,12. 만성 상처에서 볼 수 있듯이 임상 병원성 생물막의 기초가 되는 숙주-미생물 상호 작용은 오랜 기간에 걸쳐 발생합니다. 따라서, 생물막 감염의 번역으로 관련된 모델을 개발하는 것을 목표로 하는 모든 실험적 접근은 이러한 요인을 설명해야 합니다. 그래서 우리는 임상적으로 재현 가능한 돼지 만성 생물막 감염 모델을 개발하고자 했습니다.
인간 연구는 치유 결과를 연구하는 가장 좋은 방법임이 분명하지만, 근본적인 메커니즘과 새로운 기계론적 패러다임을 다루는 데 가장 적합하지 않은 경우가 많습니다. 윤리적 문제로 인해 서로 다른 시점에서 만성 상처에서 여러 생검을 수집해야 하는 연구 설계의 사용이 제한됩니다. 그러므로, 생물막 운명 7,13의 철저한 검사를 위한 침습적인 연구를 가능하게 하기 위하여 잘 확립되고 재현 가능한 동물 모형을 갖는 것이 중요하다. 동물 모델의 선택은 과학적/중개적 관련성 및 물류를 포함한 여러 요인에 따라 달라집니다. 돼지 시스템은 인간의 피부 상처를 연구하는 데 가장 중개학적으로 가치 있는 실험 모델로 널리 알려져 있다7. 따라서, 이 연구는 생물막에 감염된 전층 화상 손상의 확립된 돼지 모델을 보고한다. 이 연구는 문헌 2,7,13,14,15,16,17에 보고된 여러 원본 출판물을 기반으로 합니다. 이 연구에서는 상처를 감염시키기 위해 다제내성 녹농균(PA01)의 임상 분리를 선택했습니다. 녹농균(P. aeruginosa)은 상처 감염의 흔한 원인이다 2,18,19,20. 일부 항생제11,19,21에 대한 내성으로 인해 치료하기 어려울 수 있는 그람 음성 박테리아입니다. 지금까지 보고된 돼지 생물막 모형의 아무도는 8 주 장기 학문 22,23,24,25,26를 포함했다. 만성 상처는 4주 이상 열려 있는 상처이다 14,27,28. 문헌에 보고된 다른 만성 상처 생물막 모델은 없습니다. 이 연구는 기능적 상처 봉합 2,7,13,15,17,29의 개념을 다룹니다.
Protocol
모든 동물 연구는 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee) #21147에서 승인한 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 이 연구는 인디애나 대학의 실험실 동물 자원 센터(LARC)에서 수행되었습니다. 우리는 이 프로토콜에서 암컷 국내 흰 돼지(70-80lb)를 사용했습니다. 1. 동물 순응 돼지가 시설에 도착하면 적응과 사회적 상호 작용을 위해 최소 3일 동안 같은 방에 동물을 개별적으로 수용합니다. 돼지에게 균형 잡힌 식단을 먹이십시오. 무게에 따라 먹이는 양을 결정하고 제조업체의 권장 사항을 따르십시오. 마취 상태에서 메스꺼움, 구토 및 위액 흡인을 방지하기 위해 시술 전에 동물이 6-12시간 동안 금식했는지 확인하십시오. 2. 수술실 설치 마취 기계를 준비하고 재호흡 회로가 준비되었는지 확인하십시오. 아래 설명과 같이 수술 공간을 마련합니다(그림 1A).시술대를 멸균 드레이프로 덮고 체온 조절을 돕기 위해 그 아래에 순환 물 담요를 놓습니다. 유도 용품과 수술 준비 재료가 있는 테이블을 설정합니다. 버너 장치와 컨트롤 박스가 있는 테이블을 설정합니다. 이미징 장비를 설정하고 켜져 있는지 확인합니다. 3. 돼지의 진정제 1mL/50lb의 용량으로 TKX(텔라졸 4.4mg/kg, 케타민 2.2mg/kg, 자일라진 2.2mg/kg)를 근육 주사하여 돼지를 진정시킵니다. 마스크를 통해 전달되는 1%-3% 이소플루란으로 절차실에서 돼지를 유지합니다. IACUC 프로토콜에 따라 돼지에게 (수술 전) 진통제를 투여합니다. 몇 가지 예는 다음과 같습니다 : 부프레노르핀 0.3 mg/mL, 0.01-0.05 mg/kg IM; 카프로펜 50 mg/mL, 4 mg/kg IM 또는 SQ; 펜타닐 경피 100mcg/h를 귀의 귓바퀴에 배치; 가바펜틴 300mg 캡슐, 3-10mg/kg PO.참고: 모든 화상 및 생검 절차의 경우 수술 전날 가바펜틴 1회분, 시술 당일에 카프로펜 1회분이 제공됩니다. 메인 버닝 시술의 경우 펜타닐 패치를 부착하고 수술 준비 중에 부프레노르핀 1회분을 투여합니다. 4. 마취유도 2% 클로르헥시딘 스크럽과 알코올을 번갈아 가며 최소 3회 이상 귀를 소독합니다. A 22-18 G1을 정맥 카테터로 변연 귀 정맥에 삽입하고 혈류를 확인합니다. 식염수로 카테터를 세척하고 수술용 테이프로 카테터를 고정합니다(그림 1B). 마스크를 통한 마취 흡입으로 근육 이완이 이루어지면 적절한 크기의 기관내관(7-9mm)으로 돼지를 삽관합니다. 턱 긴장도의 손실과 관찰되는 손바닥 반사를 통해 근육 이완을 확인하십시오.튜브를 열고 공기 주사기를 사용하여 커프 누출을 테스트합니다. 후두경(30)을 사용하여 튜브를 삽입합니다. 커프를 팽창시키고 적절한 배치가 확인되면 튜브를 고정합니다. 돼지를 재호흡 회로에 연결합니다.알림: 튜브는 위에 제자리에 묶여 있으며 롤 거즈를 사용하여 고정합니다. 흉부의 청진은 튜브의 적절한 배치를 확인하기 위해 청진기로 수행됩니다.알림: 마취 중에는 위치 무기폐를 방지하기 위해 압력 압력계가 5mm/Hg에 도달할 때까지 팝오프 밸브를 닫고 재호흡 백을 눌러 10-20분마다 공기를 공급합니다. 동물과 마취 깊이를 모니터링하십시오.돼지를 다중 매개변수 모니터에 연결합니다. 모니터는 산소 포화도(SpO 2), 맥박수, 호기말 이산화탄소(EtCO2), 호흡수 및 온도를 지속적으로 읽습니다. 시술 내내 10분마다 바이탈을 기록하십시오. 상처를 입기 전에 뒷다리 발가락 꼬집음으로 통증 반사를 테스트하여 마취 깊이를 평가합니다.알림: 필요한 경우 마취 기화기를 조정하여 추가 마취를 투여하거나 몇 분 동안 기다리십시오. 수술 내내 통증 반사와 손바닥 반사를 정기적으로 확인하십시오. 5. 화상 상처를 위한 동물 준비 돼지를 마취기에서 분리하고 시술대로 옮깁니다. 돼지를 흉골 누운 자세에 놓고 연결된 모든 라인과 튜브를 고정해야 합니다(그림 1C). 돼지를 마취기에 다시 연결하고 절차가 끝날 때까지O2 를 0.8-1.5L/min으로, 이소플루란을 1%-3%로 유지합니다. 8-10mL/kg/h의 드립 속도로 돼지에게 IV 수액(LRS)을 투여합니다. 4.3단계에서와 같이 마취를 모니터링합니다. 6. 피부 화상 부위의 방부제 및 마킹 아래 설명과 같이 면도하고 제모 크림을 발라 상처 부위를 준비합니다(그림 2).전기 가위를 사용하여 척추에서 양쪽 겨드랑이까지 약 25cm 너비의 영역에서 돼지 등쪽을 면도합니다. 잘린 부위에 제모 크림을 바르고 3-7분 동안 그대로 두십시오. 깨끗한 흡수성 수건을 사용하여 머리카락과 함께 크림을 제거하십시오. 화상 부위의 준비2% 클로르헥시딘 스크럽과 70% 이소프로필 알코올을 번갈아 가며 약 5분 동안 상처 부위를 최소 3회 문지릅니다. 멸균 장갑을 착용한 직원이 스크럽을 과녁 모양(중앙에서 시작하여 나선형으로 바깥쪽으로 이동)으로 적용했는지 확인합니다. 멸균 화상 템플릿과 수술용 피부 마커를 사용하여 상처 부위를 표시합니다(그림 2B). 등쪽에 6-8개의 상처(2인치 x 2인치)를 대칭으로 표시합니다. 오염을 줄이기 위해 멸균 드레이프로 표시된 부위 주변을 덮습니다(그림 2C). 7. 화상 상처 절차 금속 스타일러스에 연결된 2인치 x 2인치 스테인리스 스틸 블록(무게: 352g), 전자 마이크로스탯 및 전자 저울(총 무게: 1,714g; 그림 3).버너를 원하는 온도로 설정하세요. 전체 두께 권선의 목표 온도를 150°C로 조정합니다(그림 3A). 이렇게 하려면 제어 장치의 설정값(SP)을 150°C로 조정하십시오. 낮은 설정값을 145°C로 설정하고 높은 설정값을 155°C로 설정합니다(그림 1D). 화상 장치에 연결된 가열된 스테인리스 스틸 블록을 사용하여 2인치 x 2인치의 전체 두께 화상 상처를 만들고 60초 동안 피부에 놓습니다(그림 3B, C). 화상을 적용하는 동안 전자 저울을 사용하여 버너에 균일한 압력이 가해지고 있는지 확인하십시오. 8. 화상 상처 평가 및 영상 촬영 디지털 사진DSLR 카메라와 전자 초점 짧은 백 포커스(EFS) 17-55mm 초음파 광각 렌즈 및 손전등을 사용하여 상처를 촬영합니다. 돼지 식별, 시간 및 날짜가 적힌 플래카드를 포함하여 전체 돼지 뒷면의 디지털 사진을 찍습니다. 그런 다음 돼지 ID, 상처 ID 및 시점, 자가 있는 플래카드를 보여주는 각 상처에 대한 이미지를 별도로 촬영합니다. 상처 부위를 백분율로 계산tage 56일까지 각 수집 시점에서 원래 상처 크기.참고: 이 작업에서 상처 면적은 각 시점(d0, d7, d14, d28 및 d56)에서 d0의 원래 상처 부위의 백분율로 계산되었습니다. 레이저 스페클 이미징(LSI)레이저 스페클 이미징의 경우 레이저 스페클 대비 분석(LASCA) 기술을 기반으로 하는 혈액 관류 이미저를 사용하여 상처 미세혈관 관류를 실시간으로 평가합니다. 한 번의 기록으로 모든 상처의 이미지를 촬영합니다. 레이저 카메라에서 상처까지의 작동 거리 측정값을 조정하여 각 상처의 이미징에 대해 일관성을 유지합니다(그림 4A). 10-15초에 걸쳐 촬영한 일련의 이미지로 관류를 기록합니다. 상처가 촬영된 후 녹화가 자동으로 일시 중지되고 카메라가 후속 상처에 맞게 조정되면 녹화가 다시 시작됩니다. 기록이 일시 중지될 때마다 상처를 식별하는 마커가 추가됩니다. 경피 수분 손실(TEWL)표준 장치, TEWL 프로브 및 소프트웨어를 사용하여 각 상처에 대한 TEWL을 측정합니다(그림 4B). 각 상처에 대해 상처 조직과 접촉할 프로브 팁 위에 깨끗한 프로브 덮개를 놓습니다. 프로브를 피부에 부드럽고 고르게 놓고 장치의 시작 버튼을 눌러 판독을 시작합니다. 각 상처를 먼저 중앙에서 측정한 다음 각 모서리에서 5번 측정합니다. 그런 다음 모든 판독값을 스프레드시트로 내보냅니다(그림 4B). 고조파 초음파(HUSD)초음파(US) 프로브로 정중선(척추)에서 시작하여 정상 피부가 다시 있는 돼지의 측면으로 상처를 스캔하여 HUSD 매핑을 수행합니다. 초음파 기계를 사용하여 B 모드와 조직 탄성 조영술 모드 모두에서 각 상처에 대해 이 스캔 패턴을 따릅니다(그림 4C).B 모드 스캔의 경우 멸균 초음파 젤을 상처 부위에 바르고 ML-615 고해상도 프로브에 약간 바릅니다. 각 기록에 상처 식별 라벨을 주석으로 답니다. 녹음을 시작하고 반대쪽의 정상 피부에 도달할 때까지 프로브를 정중선에서 상처 아래로 천천히 움직입니다.참고: 스캔이 끝나면 기록이 저장되고 분석을 위해 기기에서 내보내집니다. 엘라스토그래피의 경우 Elasto 버튼을 눌러 초음파 기계를 엘라스토 모드로 전환합니다. B 모드 스캔과 동일한 방식으로 상처를 다시 스캔하여 레터스토그래피 색상 표시기(녹색 막대)가 녹화 내내 계속 보일 수 있도록 프로브의 균일한 압력이 유지되도록 합니다.알림: 적절한 압력은 올바른 접촉이 이루어지면 녹색으로 나타나는 기록의 눈금 막대로 결정할 수 있습니다(그림 4D). 각 상처가 B 모드와 엘라스토 모드 모두에서 이미징된 후 주석을 변경합니다(상처당 2회 기록). 소프트웨어에서 설명을 변경하여 다음 상처에 대한 정보를 포함하고 후속 상처에 대해 이 과정을 반복합니다. 9. 붕대 및 드레싱 화상 상처는 투명 필름 드레싱 또는 테스트 드레싱으로 개별적으로 덮습니다(그림 5A, B). 상처 부위 전체에 더 큰 투명 필름 드레싱을 바릅니다(그림 5C). 돼지의 몸통 전체에 롤 거즈를 두 겹으로 느슨하게 발라 상처에서 나오는 액체를 흡수합니다. 돼지를 옆에서 뒤로 약간 뒤로 굴려 돼지 주위에 붕대를 감습니다. 유연한 탄성 붕대 층으로 거즈를 느슨하게 덮습니다(그림 5D). 붕대를 너무 꽉 조이면 호흡이 제한되고 복부에 압력이 가해져 직장 탈출증이나 다른 합병증이 발생할 수 있으므로 붕대가 너무 꽉 조이지 않도록 하십시오.알림: 탄력 붕대는 신축성이 있어 적용 중에 쉽게 과도하게 조일 수 있습니다. 롤에서 당겨서 이전 랩의 가장자리 위에 놓으면 과도하게 조이는 것을 방지하는 데 도움이 될 수 있습니다. 탄성 테이프의 마지막 4층으로 탄성 붕대를 덮습니다(그림 4E). 다시 말하지만, 도포가 너무 꽉 조이지 않도록 하되 드레싱이 상단 및 하단 가장자리에 고정되어 시술 후 돼지가 움직일 때 미끄러지지 않도록 하십시오. 10. 동물 회복 및 수술 후 관리 복구상처, 영상 절차 및 붕대 감기가 완료되면 마취 가스를 중단하십시오. 돼지가 최소 5분 동안 산소에 머물도록 하십시오. 기본 인클로저로 돌아간 후 돼지를 운송/리프트 테이블에서 케이지의 폼 회수 매트로 옮깁니다. 자동 급수기를 올리고 j-feeder를 제거하여 회복 중 돼지가 다치는 것을 방지합니다. 저체온증이 있는 경우 돼지를 담요(따뜻한 공기 담요 포함)로 덮으십시오. 2-10분마다 온도, 맥박, 호흡수 및 SpO15 를 포함한 바이탈을 모니터링하고 기록합니다. 돼지가 흉골 누운 자세를 독립적으로 유지할 수 있을 때까지 지속적으로 모니터링합니다. 돼지가 완전히 회복되면 젖꼭지 급수기를 내리면 돼지에게 먹이를 줄 수도 있습니다. 통증 평가수정된 Glasgow 통증 점수 양식을 사용하여 수술 후 통증 평가를 수행합니다. 수술 후 처음 12-3일 동안 최소 4시간마다 실험실 또는 LARC 직원이 통증 평가를 완료하도록 합니다. 통증 점수의 빈도는 담당 수의사가 결정합니다. 동물의 점수가 5점 이상이면 구조 진통제(부프레노르핀 또는 하이드로모르폰)를 투여합니다. 시술 전 부프레노르핀 0.01-0.05mg/kg IM을 투여하여 진통을 제공하고 8-12시간 후에 두 번째 투여를 합니다. 화상을 입기 전에 귀 귓바퀴에 펜타닐 패치(100mcg/h)를 붙입니다. 시술 전 카르프로펜 4mg/kg IM 또는 SQ를 주사한 다음 2일 동안 매일 한 번 IM, SQ 또는 PO를 주사하거나 LARC 수의사의 지시에 따라 주사합니다. 가바펜틴을 3-10mg/kg을 경구 투여하고, 시술 전날, 시술 당일 아침, 시술 다음날 저녁, 3-5일 동안 12시간마다 투여합니다. 다이어트돼지가 회복되었는지 확인한 다음 하루에 두 번 체중 기반 배급량에 따라 물과 음식을 자유롭게 사용할 수 있도록 합니다. 식품 농축 식품(신선한 과일과 채소, 냉동 과일, 마시멜로, 요구르트, 푸딩 등)을 제공하고 식욕 감소가 관찰되면 이를 사용하여 식사를 유도하십시오. 드레싱 변경적어도 일주일에 한 번 또는 붕대가 더러워진 경우 또는 치료 전략을 수용하기 위해 더 자주 붕대를 교체하십시오. 마취 상태에서 영상 촬영 후 붕대를 교체하거나 드레싱 교체를 위해 TKX만으로 돼지를 진정시킵니다. 붕대를 교체하려면 먼저 리스터 붕대 가위나 외상 가위를 사용하여 드레싱 외부가 상처에 닿지 않도록 주의하면서 더러워진 붕대를 조심스럽게 제거합니다. 필요한 경우 깨끗한 거즈에 0.9% NaCl을 사용하여 상처 주변을 청소하고 해당 부위를 부드럽게 건조시킵니다. 섹션 9에 설명된 붕대 붕대 절차 단계를 따르십시오.참고: 실험용 드레싱을 적용하는 경우 투명 필름 드레싱으로 상처를 덮기 전에 적용할 수 있습니다. 이미징 주파수연구 전반에 걸쳐 다양한 시점에서 이미징(디지털 사진, LSI, TEWL 및 HUSD)을 얻습니다. 접종 후 -3일(화상 상처), 0일(접종), 7일, 14일, 28일, 35일, 56일에 영상 데이터를 수집합니다. 11. 생물막 제조 및 접종 접종 준비박테리아의 순수 배양을 위해 녹농균(Pseudomonas aeruginosa , PA01)의 글리세롤 냉동고 스톡에서 스타터 플레이트를 준비합니다. 녹농균 배양액을 저염 Luria-Bertani 한천(LBA)에서 배양하고 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음날 저염 Luria-Bertani 육수(LBB) 5mL를 녹 농균 콜로니 1개를 접종하고 37°C에서 200rpm으로 진탕하면서 밤새 배양합니다. 로그 상 세포를 얻기 위해 200μL의 야간 배양액을 5mL의 LBB에 접종하고 37°C에서 200rpm으로 2.5시간 동안 Shaker에서 배양합니다. 분광 광도계를 사용하여 600nm(OD600)에서 광학 밀도를 측정합니다. 900 μL의 멸균 LBB에서 배양액의 100 μL를 사용하여 최대 1 x 10−9 의 연속 희석액을 준비합니다.참고: 희석되지 않은 샘플로 시작하여 1 x 10 7 CFU/mL로 끝났습니다.1 x 107 희석에서 계산 가능한 콜로니를 얻었으므로 이 희석을 최종 희석으로 간주했습니다. 각 희석액을 LBA에 100μL씩 펴 바르고 37°C에서 밤새 배양합니다. 표준 미생물 프로토콜에 따라 콜로니 수에 대해 셀 수 있는 콜로니(30-300)를 보여주는 희석액을 사용하고 콜로니 형성 단위(CFU)를 얻습니다. 상처의 접종하룻밤 배양액 200μL를 LB 육수 5mL에 접종하고 37°C의 셰이커에서 2.5시간 동안 배양합니다. 600nm(OD600)에서 데이 배양의 광학 밀도를 측정합니다. PA01 접종의 경우 3 x 10 8 CFU/mL를 사용합니다(상처당 1 x 108 CFU/mL PA01 250μL 접종). 접종물을 생물학적 위험 컨테이너에 담아 동물 시설로 운송합니다. 피펫을 사용하여 화상 후 3일째에 노출된 상처 표면에 접종물을 분산시키고 일회용 스프레더를 사용하여 고르게 펴 바릅니다(그림 6). 붕대를 감기 전에 약 15분 동안 상처를 열어 두십시오.참고: 모든 수술 절차, 접종, 조직 생검, 영상 및 붕대 감기는 섹션 3 및 4에서와 같이 전신 마취 하에 수행됩니다. 감염 확진 확인참고: 접종 후 상처가 성공적으로 감염되었는지 확인하기 위해 몇 가지 접근 방식을 사용하고 상처 샘플을 정상 피부에서 채취한 샘플과 비교합니다. 다음은 몇 가지 예입니다.서로 다른 시점에서 수집된 샘플의 병리학 기반 분석의 경우 콜로니 형성 단위의 수를 사용하여 감염을 추정합니다(CFU; 그림 7E, F).펀치 생검으로 6mm의 상처 조직을 채취합니다. 빈 5mL 둥근 바닥 튜브에 라벨을 부착하고 무게를 잰다. 샘플을 튜브로 옮기고 샘플로 튜브의 무게를 잰다. 멸균 표면에 메스로 조직을 깍둑썰기합니다. BSL2 후드의 모든 단계를 수행합니다.알림: 조직이 쉽게 균질화되도록 하려면 크기가 매우 작아야 합니다(0.5mm 이상). 샘플을 튜브에 넣고 PBS 1mL를 추가합니다. 단단한 조직 분쇄 프로브를 사용하여 조직을 혼합하고 분쇄합니다. 균질액을 순차적으로 희석(1 x 10−5로 희석하지 않음)하고 선택적(Pseudomonas Isolation Agar, PIA) 및 비선택적(LBA) 배지에서 각 희석액을 50μL로 플레이트합니다. 모든 희석액을 37°C의 호기성 조건에서 18-24시간 동안 배양합니다. 적절한 조명 조건으로 플레이트를 이미지화합니다. 30-300개의 콜로니가 있는 플레이트를 선택하고 플레이트가 해당 농도에 도달하지 않은 경우 희석되지 않은 플레이트를 사용하십시오. ImageJ를 사용하여 콜로니 수를 계산하고 평균값에 최종 희석 계수를 곱하여 플레이트당 CFU를 계산합니다. 주사전자현미경(SEM)을 사용하여 접종 후 7일째 및 기타 시점에서 수집된 샘플에서 이미지를 획득하여 박테리아 생물막의 존재를 확인합니다(그림 7G).참고: 접종 후 7일째는 생물막 감염이 확립되고 화상 에스카가 연화되기 시작하는 날이기 때문에 선택되었으며, 이는 미국 파동의 침투를 허용하여 더 깊은 조직의 시각화를 허용합니다. 그림 4에서 3일차 미국 화상 상처 이미지를 확인하면 미국 파동이 더 깊은 조직으로 통과하는 것을 방지하는 두꺼운 가죽 에스카를 보여줍니다. 이전 간행물13(그림 7H)에서 볼 수 있듯이 P. aeruginosa에 대한 특이적 항체로 상처 생검 절편을 염색하여 특정 박테리아의 존재를 확인합니다. Sinha et al.31에 발표된 차세대 염기서열분석(NGS)을 수행합니다. 감염된 상처에서 박테리아 16srRNA와 접종 후 7일차부터 연구가 끝날 때까지 서로 다른 시점에서 수집된 정상적인 감염되지 않은 피부 샘플을 정량화합니다. 12. 생검 수집 접종 후 7일, 14일, 28일 및 56일에 이미징 후 분석을 위해 조직 생검을 수집합니다. 치유 과정에 대한 간섭을 최소화하기 위해 각 상처에서 한 번만 생검을 수집하십시오.참고: 모든 수술 절차, 접종, 조직 생검, 영상 및 붕대 감기는 섹션 3 및 4에서와 같이 전신 마취 하에 수행됩니다.0.5% 부피바카인으로 상처 주위 부위에 침투합니다. 상처의 한쪽 가장자리에서 다른 쪽 가장자리까지 3-4mm 너비의 스트립을 자르고 크기 10 칼날이 달린 일회용 메스를 사용하여 양쪽에 정상 피부의 작은 여백을 유지합니다. 고정을 위해 4% 완충 포르말린으로 채워진 라벨이 붙은 원뿔형 튜브에 스트립을 넣습니다.참고: 초기 시점 이미징 및 생검 절차의 경우 수술 준비 중에 부프레노르핀을 완전히 투여합니다. 늦은 시점 생검 절차의 경우, 수술 준비 중에 부프레노르핀의 절반을 투여합니다. 모든 화상 및 생검 절차 후 가바펜틴은 담당 수의사의 조언에 따라 최대 7일 동안 BID를 투여합니다. 카프로펜은 수술 후 며칠 동안 또는 담당 수의사의 조언에 따라 투여됩니다. 상처 부위(상처 부위 또는 상처 가장자리)에서 6mm 펀치 생검을 자릅니다. 다양한 유형의 분석을 위해 정상 피부의 일부와 상처 부위를 포함한 상처 가장자리에서 수집합니다. 멸균된 집게와 해부 가위를 사용하여 샘플을 제거합니다. 생검 샘플을 처리 및 분석을 위해 적절한 튜브 또는 카세트에 넣습니다. CFU, SEM, RNA 및 FPPE의 경우 적절한 완충액을 사용하여 샘플을 튜브에 보존합니다. 예를 들어, 레이저 캡처 현미경(LCM) 및 면역조직화학(IHC)을 위해 카세트의 OCT에 샘플을 배치할 수 있습니다. 검체를 채취한 후 멸균 거즈로 상처를 부드럽게 눌러 지혈을 합니다. 비부착성 드레싱으로 상처를 덮고 섹션 9와 같이 붕대를 감습니다. 13. 안락사 및 조직 채취 안락사 당일 TKX로 돼지를 진정시키고 이소플루란으로 마취합니다. 섹션 3에 설명된 단계에 따라 변연부 외이정맥에 정맥 카테터를 삽입합니다. 섹션 4의 단계에 따라 돼지를 삽관합니다. 돼지가 마취되면 붕대를 제거하고 상처 주변을 청소하십시오. 완벽한 디지털 사진, LSI, TEWL 및 HUSD 이미징. 섹션 12에 설명된 단계에 따라 상처와 정상 피부에서 샘플을 수집합니다. 필요한 모든 샘플이 수집되면 시중에서 판매되는 안락사 용액(펜토바르비탈나트륨)을 정맥 주사 하여 마취 상태에서 돼지를 인도적으로 안락사시킵니다. 청진기를 사용하여 청진하여 심장 박동과 자발 호흡의 정지를 확인합니다. SOM IACUC에서 요구하는 대로 메스를 사용하여 기흉을 유도하여 2차 안락사 방법을 수행합니다. 돼지 사체를 통에 옮기고 냉동실로 운반하여 소각합니다.
Representative Results
표준화된 화상 장치를 사용하여 150°C에서 1분 동안 전층 화상 상처를 만들었으며, 그 결과 홍반과 염증의 균일한 가장자리를 가진 균일한 심부 화상이 발생했습니다(그림 3 및 그림 7). 각 돼지는 그림 3C에 묘사된 것처럼 등에 8개의 전신 화상을 입었습니다. 상처 깊이와 시간 경과에 따른 상처 치유 진행을 확인하기 위해 B 모드 고해상도 초음파로 화상 상처에 대한 비침습적 실시간 평가는 피하 지방까지 모든 피부층이 파괴되었음을 보여주었습니다(그림 4). 레이저 스페클 이미징(LSI)은 상처 관류의 추가 특성화를 위해 사용되었습니다(그림 4A). 화상 상처는 접종 후 7일째까지 상처 표면에 두꺼운 화농성 막을 보여주었고, 따라서 감염 및 화상 상처 생물막의 확립을 확인했습니다(그림 7A). 디지털 평탄측정법은 PAO1 접종 후 3일째에 상처 부위와 가장자리의 염증 반응으로 인해 상처 부위가 증가한 것을 보여주었습니다(그림 7A,B). 접종 후 14일째부터 상처 부위가 줄어들기 시작했지만, 56일째에는 원래 상처 크기의 약 25%까지 불완전하게 치유되는 것이 관찰되었으며, 이는 상처의 만성성을 나타냅니다(그림 7B). 상처 만성 및 상처 치유 장애는 TEWL에 의해 추가로 확인되었으며, 이는 높은 경피 수분 손실을 보여주었습니다. TEWL 결과는 측정된 시점에 대해 정상 피부와 비교하여 피부 장벽 기능의 손실을 반영하여 화상 상처 치유의 기능적 손상을 나타냅니다(그림 7B). 이는 또한 육안 상처 봉합에도 불구하고 35일(중간) 및 56일(후기)에 관찰된 높은 TEWL 값에 반영된 바와 같이 단단한 접합 단백질 ZO-1 및 213의 억제 및 피부 장벽 기능 회복의 손상에 의해 확인되었습니다(그림 7I). 화상 깊이는 그림 7C와 같이 모든 조직학적 피부층의 왜곡 및 괴사를 보여주는 H&E 염색에 의해 추가로 검증되었습니다. PA01의 확립된 생물막은 접종 후 7일째에 CFU(그림 7E,F), SEM 이미징(그림 7G) 및 면역형광 염색(그림 7H)에 의해 추가로 검증되었습니다. 그림 1: 시술 설정 (A) 수술대 준비. (B) IV 수액 및 약물 투여를 위한 귀 정맥 캐뉼레이션. (C) 시술 중 저체온증으로부터 돼지를 보호하기 위한 열 담요 덮개. (D) 버너 및 타이머 설정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 2: 수술 부위 멸균 및 마킹 . (A) 머리 깎기 및 살균. (B) 멸균 8개의 상처가 있는 표준 템플릿을 사용한 화상 부위 표시(각 상처는 2인치 x 2인치). (C) 멸균 피부 마커를 사용한 최종 마킹. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 3: 화상 상처 유도. (A,B) 압력 게이지와 자동 컨트롤러 장치(2인치 x 2인치)가 있는 표준화된 버너가 미리 표시된 상처 부위에 적용됩니다. (C) 여덟 군데의 전신 화상을 보여주는 등 전체. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 4: 비침습적 화상 영상 및 평가 . (A) 레이저 빔 표시기가 상처 중앙으로 적절한 방향을 가진 레이저 스페클 이미징(LSI)이 왼쪽 이미지에 표시됩니다. 오른쪽 이미지는 LSI 장치와 실시간 피부 혈관 관류 맵을 보여줍니다. (B) 5개의 다른 지점(4개의 상처 모서리와 오른쪽 하단 모서리 이미지에 표시된 중앙)의 상처 부위에 대한 경피 수분 손실(TEWL) 프로브 적용이 왼쪽 이미지에 나와 있습니다. 오른쪽 이미지는 TEWL 측정의 대표적인 실시간 캡처 화면입니다. (C) 고해상도 16MHz 초음파 프로브를 사용한 화상 상처의 고조파 초음파 스캔이 왼쪽에 표시됩니다. 오른쪽 이미지는 초음파 장치와 실시간 화면 녹화를 보여줍니다. (D) 접종 당일 및 접종 후 7일째에 화상 상처 부위의 구조적(B-모드 이미지, 회색조 초음파) 및 생체 역학적(엘라스토그래피, 컬러 초음파) 이미지. 상처 깊이는 노란색 점선으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 5: 상처 드레싱 및 붕대. (A) 각 상처에 대해 투명 필름 드레싱을 개별적으로 도포합니다. (B) 등쪽에 접종된 모든 화상 상처는 첫 번째 드레싱으로 덮여 있습니다. (C) 더 큰 투명 필름 드레싱을 전체 상처 부위에 배치합니다. (D) 거즈의 두 번째 층을 적용하고 돼지의 전체 몸통에 신축성 있는 탄성 붕대를 느슨하게 감아 상처에서 나오는 삼출액을 흡수합니다. (E) 접착 드레싱에서 4의 마지막 층으로 전체 상처 부위를 덮습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 6: 세균 접종 . (A) 화상 후 01일째에 녹농균( PA3) 접종을 위한 설정. (B) 각 상처에 대해 500μL 부피를 사용하는 피펫으로 접종물을 국소 도포합니다. (C) 접종물은 멸균 일회용 스프레더를 사용하여 상처 표면에 고르게 분산됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 7: 상처 치유 진행 및 생물막 확인. (A) 연구 기간 동안 상처 봉합의 대표 이미지. 눈금 막대 = 1cm. (B) 연구 타임라인에 대한 상처 부위 및 TEWL 측정의 정량화(n = 6). 데이터는 평균 ± SD로 표시되며, NS는 정상 피부의 TEWL 값을 나타냅니다. (C) 다양한 상처 생검 부위를 보여주는 개략도. 디. 화상 후 3일째 및 접종 후 7일째에 모든 피부층의 왜곡과 괴사를 보여주는 해당 Masson’s trichrome 염색을 사용한 H&E 염색. 눈금 막대 = 500μm. (E) 돼지 상처 침대 조직에서 성장한 박테리아 콜로니가 있는 비선택적 한천(Luria-Bertani 한천) 및 선택적 한천(Pseudomonas Isolation Agar)의 대표적인 디지털 이미지. 선택적 매체를 사용하면 PA01 콜로니만 정확하게 계수할 수 있습니다. (F) 처리된 접종 후 7일차 상처 생검에서 채취한 콜로니 수에서 샘플 콜로니 형성 단위(CFU) 계산이 표시됩니다. (G) 접종 후 7일째에 접종된 화상 상처의 대표적인 주사전자현미경(SEM) 이미지는 오른쪽에 확대된 이미지와 함께 확립된 PA01 생물막을 보여줍니다. 눈금 막대 = 1μm. 빨간색 화살촉은 세포외 고분자 물질(EPS)을 가리킵니다. (H) 화상 상처의 녹농균은 항-슈도모나스(녹색) 항체를 사용하여 시각화하였다; 접종 후 7일차 상처 생검의 면역형광 이미지는 녹농균에 의한 상처 조직의 심한 집락화를 보여줍니다. 눈금 막대 = 100μm. (I) 접종 후 35일째 및 56일에 ZO-1 및 ZO-2 염색 섹션의 대표 모자이크(눈금 막대 = 200μm) 및 해당 확대(눈금 막대 = 50μm) 이미지, 유도 감염 후 단백질 발현 감소를 보여줍니다. OCT 포매 동결 절편(10μm)은 항-ZO-1(녹색) 또는 항-ZO-2(녹색)를 사용하여 염색하였다. 단면은 DAPI를 사용하여 대조염색되었습니다. 막대 그래프는 ZO-1 및 ZO-2 신호 강도의 정량을 나타냅니다. 데이터는 평균± SD(n = 3)로 표시됩니다. * p< 0.05 자발적인 것과 비교. 유의성을 검정하기 위해 Mann-Whitney 또는 Kruskal-Wallis 일원 분산 검정을 수행했습니다. 그림 7H,I는 Roy et al.13에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
이 보고서는 실험 연구를 위해 만성 상처 생물막 감염의 돼지 모델을 설정하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 몇몇 돼지 biofilm 모형은 22,23,24,25,26 이전에 보고되었습니다, 그러나 그(것)들의 아무도는 8 주 장기 학문을 포함하는 돼지 모형이 아닙니다. 만성 상처는 4주 이상 열려 있는 상처이다 14,27,28. 문헌에 보고된 다른 만성 상처 생물막 모델은 없습니다. 이 연구는 기능적 상처 봉합 2,7,13,15,17,29의 개념을 다룹니다. 2014년에 수행된 한 연구는 생물막에 감염된 상처가 장벽 기능을 회복하지 않고도 봉합될 수 있다고 최초로 보고했다7. 이 연구에서는 경피 수분 손실(TEWL)을 사용하여 치유되는 상처의 피부 장벽 기능 측정이 보고됩니다.
해부학적으로나 생리학적으로 돼지 피부는 다른 작은 동물의 피부와 비교했을 때 인간의 피부와 더 가깝다(32,33,34). 돼지와 인간의 피부는 모두 두꺼운 표피(33)를 가지고 있으며, 진피-표피 두께 비율은 돼지에서 10:1 내지13:1로 인간(34,35)과 비슷하다. 조직학적으로나 생체역학적으로 인간과 돼지의 피부는 망피융지, 피하지방, 진피 콜라겐, 모발 분포, 부속기 구조, 혈관 크기 및 분포에서 유사성을 보인다36,37,38. 기능적으로 돼지와 인간은 표피층의 지질, 단백질 및 케라틴 성분의 구성과 유사한 면역조직학적 패턴에서 유사성을 공유합니다37,38. 돼지의 면역 체계는 다른 작은 동물의 면역 체계와 비교했을 때 인간의 면역 체계와 더 높은 유사성을 공유하는데, 이는 돼지가 상처 감염에서 병리학적 생물막의 복잡성에 필수적인 숙주 상호 작용에 대한 연구에 적합한 모델이라는 것을 의미한다39. 다양한 동물 모델이 제공하는 장단점에 대한 비판적 평가는 돼지가 상처 치유를 연구하는 데 효율적인 모델이라는 합의로 이어졌습니다34,38. 또한, 사육 돼지는 인간에서 관찰되는 만성 세균 감염을 자발적으로 발생시킨다10. 상처를 생성하는데 사용되는 화상 장치는 표적 피부 부위(22,40)로부터 판독된 온도에 기초하여 열 에너지를 전달하는 진보되고 자동화된 화상 장치이다. 이러한 접근 방식은 화상 부상의 엄격함과 재현성을 향상시킵니다. 돼지 상처를 감염시키기 위해 박테리아의 인간 임상 분리체를 사용하는 것은 전임상 모델로서 가치를 더합니다.
화상 부상은 복잡하며 여러 가지 전신 교란을 일으킨다20,41. 따라서 적절한 수분으로 돼지를 소생시키고 마취 및 회복 중 저체온증을 예방하는 것이 중요합니다. 화상 후 영양, 체액 및 통증을 포함한 여러 요인이 상처 치유를 방해할 수 있다42. 따라서 영양 및 통증 평가에 대한 면밀한 모니터링이 중요합니다. 화상 후 통증은 심할 수 있으며 동물의 행동과 식단에 영향을 미칠 수 있습니다. 행동 문제를 해결하기 위한 개입을 적극적으로 고려해야 합니다. 정기적이고 지속적인 통증 점수 및 관리가 필수적입니다. 매우 상세한 통증 관리 계획이 포함된 철저한 통증 평가 시트가 이 프로토콜에 포함되어 있습니다. 상처 사이의 교차 오염을 방지하려면 각 상처에 드레싱의 첫 번째 층을 별도로 적용하는 데 특별한 주의를 기울여야 합니다. 모든 생물학적 위험 물질을 취급하고 장비, 도구 및 전체 수술실을 철저히 소독할 때 세심한 주의를 기울여야 합니다. 드레싱을 여러 겹 바르면 돼지가 가려운 등을 문지르거나 긁으려고 노력하는 동안 상처가 노출되는 것을 방지할 수 있습니다.
현재 모델의 돼지는 근본적인 대사 장애(예: 당뇨병)에 의해 손상되지 않았으므로 연구 중인 효과는 순전히 상처 치유에 대한 박테리아 생물막 감염의 영향이었습니다. 그러나 이 모델은 당뇨병 유도(예: 스트렙토조토신 사용)에 적합하며 근본적인 대사 장애와 관련하여 생물막 감염을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 모델의 또 다른 한계는 박테리아인 녹농균(P. aeruginosa)을 이용한 감염 설정을 조절하는 것입니다. 돼지의 정상적인 피부 미생물총도 상처에서 자랄 수 있으며 치유에 영향을 미칠 수 있습니다. 상처의 미생물 함량을 설명하기 위해 NGS 또는 기타 고급 기술을 사용한 추가 분석이 필요합니다. 현재 모델은 서로 다른 미생물 종(예: 곰팡이, 바이러스 등)과의 혼합 감염에도 적용될 수 있습니다. 이는 임상적으로 관련된 상처가 혼합 미생물에 의해 채워질 가능성이 높기 때문에 상처 치유에 차별적으로 영향을 미칠 수 있기 때문에 중요한 요소입니다.
이 모델에는 인간 만성 상처의 복잡성 및 장기 후유증과의 유사성, 자동화되고 재현 가능한 화상 과정, 임상적으로 분리된 박테리아 종의 사용 등 많은 잠재적인 이점이 있습니다. 여러 비침습적 이미징 방식을 사용하는 것은 상처를 특성화하는 유용한 생리학적 데이터를 수집하기 위한 강력한 접근 방식입니다. 마지막으로, TEWL을 기반으로 한 피부 장벽 기능 회복을 통한 기능적 상처 치유 평가가 중요합니다. 결론적으로, 돼지 모델 시스템을 사용하여 생물막에 감염된 중증 화상 부상을 개발하기 위한 강력하고 간단하며 상세하고 사용하기 쉬운 프로토콜이 이 연구에서 보여집니다.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
인디애나 대학교의 실험실 동물 자원 센터(LARC)의 지원과 연구 기간 동안 동물을 수의사로 돌봐 주신 데 대해 감사드립니다. 이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 보조금 NR015676, NR013898 및 DK125835와 국방부 보조금 W81XWH-11-2-0142의 지원을 받았습니다. 또한 이 연구는 GM077185, GM069589, DK076566, AI097511 및 NS42617와 같은 미국 국립보건원(National Institutes of Health) 상의 혜택을 받았습니다.
Materials
| Sedation | |||
| Ketamine | Zoetis | 10004027 | 100mg/ml |
| Telazol | Zoetis | 106-111 | 100mg/ml |
| Xylazine | Pivetal | 04606-6750-02 | 100mg/ml Anased |
| 3ml syringe w/ 20g needle | Covidien-Monoject | 8881513033 | |
| Winged infusion set 21g | Jorgensen Labs | J0454B | |
| Anesthetic | |||
| Isoflurane | Pivetal | 21295097 | |
| Surgery | |||
| Hair clippers | Wahl | 8787-450A | |
| Nair | Church and Dwight Co. Inc | 70506572 | |
| Chlorhexidine Solution | First Priority Inc. | 179925722 | |
| 70% Isopropyl Alcohol | Uline | S-17474 | |
| 0.9% Saline Solution | ICU Medical | RL-7282 | |
| Non-woven gauze | Pivetal | 21295051 | |
| Paper tape | McKesson | 455531 | |
| 2" Elastic tape | Pivetal | 21300869 | |
| 18-22g Intravenous Angiocath | SurVet | (01)14806017512306 | |
| Spay hook | Jorgensen Labs | J0112A | |
| Sterile lube | McKesson | 16-8942 | |
| Laryngoscope | Jorgensen Labs | J0449S | |
| Roll gauze | Pivetal | 21295032 | |
| Endotracheal tube (7-9mm) | Covidien | 86112 | Shiley Hi-Lo Oral Nasal Tracheal Tube Cuffed |
| 15gtt/ml IV administration set | ICU Medical | 12672-28 | |
| LRS 1000ml bag | ICU Medical | 07953-09 | |
| Three Quarter Drape Sheet | McKesson | 16-i80-12110G | |
| Analgesia | |||
| Buprenorphine | RX Generics | 42023-0179-05 | 0.3mg/ml |
| Fentanyl Transdermal | |||
| Carprofen | 21294548 | Pivetal | 50mg/ml Levafen |
| Bandaging | |||
| Transparent film dressing 26×30 | Genadyne Biotechnologies | A4-S00F5 | |
| Film dressing 4 x 4-3/4 Frame Style | McKesson | 886408 | |
| Vetrap | 3M | 1410BK BULK | |
| Elastic tape 4" | Pivetal | 21300931 | |
| Kerlix Roll Gauze | Cardinal Health | 3324 | |
| Imaging | |||
| Canon EOS 80D | Canon | 1263C004 | |
| Speedlight 600EX II-RT | Canon | 1177C002 | |
| EFS 17-55mm Ultrasonic | Canon | 1242B002 | |
| GE Logiq E9 | GE | 5197104-2 | |
| ML6-15 Probe | GE | 5199103 | |
| PeriCamPSI | Perimed | 90-00070 | |
| DermaLab | Cortex Technologies Inc | 4608D78 | |
| Biopsy/Tissue Collection | |||
| 6mm punch biopsy | Integra Lifesciences | 33-36 | |
| bupivicaine 0.5% | Auromedics Pharma | 55150017030 | |
| Size 10 Disposable Scalpel | McKesson | 16-63810 | |
| Dissection scissors | Pivetal | 21294806 | |
| Rat tooth thumb tissue forceps | Aesculap | BD512R | |
| Non-adherent Dressing | Covidien | 2132 | Telfa |
| 50ml Conical tube | Falcon | 352070 | |
| Eppendorf/microcentrifuge tube | Fisherbrand | 02-681-320 | |
| OCT Cassette | |||
| Non Woven Gauze 4×4 | Pivetal | 21295051 | |
| Inoculum | |||
| Low salt LB agar | Invitrogen | 22700-025 | |
| Low salt LB broth | Fisher scientific | BP1427-500 | |
| Petri plate | Falcon | REF-351029 | |
| Polyprophyline round bottom tubes (14 ml) | Falcon | REF-352059 | |
| Pseudomonas Agar Base (Dehydrated) | Thermo Scientific | OXCM0559B | |
| LB Agar, powder (Lennox L agar) | Thermo Fisher Scientific (Life Technologies) | 22700025 | |
| Gibco™ DPBS, calcium, magnesium | Gibco | 14040133 | |
| Euthanasia | |||
| 18-22g Intravenous Angiocath | SurVet | (01)14806017512306 | |
| Fatal Plus | Vortech Pharmaceuticals | 9373 |
参考文献
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