Ex Vivo Мультимодальная визуализация донорских глаз человека на основе ОКТ для исследования возрастной макулярной дегенерации

Пятнадцать лет лечения неоваскулярной возрастной макулярной дегенерации (ВМД) с помощью анти-VEGF-терапии под руководством оптической когерентной томографии (ОКТ) позволили по-новому взглянуть на последовательность прогрессирования и микроархитектуру этой распространенной причины потери зрения. Ключевым признанием является то, что ВМД является трехмерным заболеванием, поражающим нейросенсорную сетчатку, пигментный эпителий сетчатки (RPE) и сосудистую оболочку. В результате ОКТ-визуализации исследуемых пациентов и других глаз пациентов клиники, прошедших лечение, в настоящее время признаны особенности патологии, выходящие за рамки тех, которые видны при цветной фотографии глазного дна, являющейся клиническим стандартом на протяжении десятилетий. К ним относятся интраретинальная неоваскуляризация (макулярная неоваскуляризация^{1 типа 3}, ранее ангиоматозная пролиферация), субретинальные друзеноидные отложения (SDD, также называемые ретикулярными псевдодрузами)², множественные пути судьбы RPE^3,4 и интенсивно глиотические клетки Мюллера при атрофии ^5,6.

Модельные системы, в которых отсутствуют макулы (клетки и животные), воссоздают некоторые срезы этого сложного заболевания ^7,8,9. Дальнейший успех в облегчении бремени ВМД может быть достигнут благодаря открытию и исследованию первичной патологии в глазах человека, пониманию уникального клеточного состава макулы с последующей трансляцией в модельные системы. В этом отчете рассказывается о тридцатилетнем сотрудничестве между академической исследовательской лабораторией и глазным банком. Описанные здесь методы характеризации тканей преследуют две цели: 1) информировать развивающуюся диагностическую технологию, демонстрируя основы внешнего вида глазного дна и источников сигнала визуализации с помощью микроскопии, и 2) классифицировать образцы ВМД для целевых (иммуногистохимия) и нецелевых методов молекулярного обнаружения (масс-спектрометрия визуализации, IMS и пространственная транскриптомика), которые сохраняют только колбочку и богатые палочками пара- и перифовеи. Такие исследования могут ускорить переход к клинической ОКТ, для которой последовательность прогрессирования и продольное наблюдение возможны с помощью отслеживания взгляда. Эта технология, предназначенная для мониторинга эффектов лечения, регистрирует сканирование от одного посещения клиники до другого с использованием сосудов сетчатки. Связь ОКТ с отслеживанием глаз с лабораторными результатами, полученными с помощью деструктивных методов, может обеспечить новый уровень прогностической ценности молекулярных результатов.

В 1993 году исследовательская лаборатория сделала цветные фотографии посмертного глазного дна на^{пленку 10}. Эти усилия были вдохновлены превосходной фотомикроскопией и гистологией периферической сетчатки человека Foos и его коллегами 11,12,13 и обширными клинико-патологическими корреляциями AMD Sarks et ^al.14,15. Начиная с 2009 года, была принята мультимодальная визуализация ex vivo (MMI), основанная на ОКТ в спектральной области. Этот переход был вдохновлен аналогичными усилиями других 16,17 и особенно осознанием того, что большая часть ультраструктуры, описанной Сарками, со временем была доступна в трех измерениях в клинике ^18,19. Цель состояла в том, чтобы получить глаза с прикрепленными макулами в разумные сроки для мощных исследований фенотипов клеточного уровня в сетчатке, RPE и сосудистой оболочке. Цель состояла в том, чтобы выйти за рамки статистики «на глаз» к «типу поражения», стандарту, на который повлияли концепции «уязвимого налета» от сердечно-сосудистых заболеваний^20,21.

Протокол, приведенный в этом отчете, отражает опыт присоединения почти 400 пар донорских глаз в нескольких потоках. В 2011-2014 гг. был создан веб-сайт проекта MACULA по гистопатологии ВМД, который включает толщину слоев и аннотации из 142 архивных образцов. Эти глаза были сохранены с 1996 по 2012 год в глутаральдегидно-параформальдегидном фиксаторе для гистологии эпоксидной смолы высокого разрешения и электронной микроскопии. Все фундусы были сфотографированы в цвете при получении и были повторно сфотографированы с помощью ОКТ непосредственно перед гистологией. Держатель для глаз, первоначально разработанный для исследований^{зрительного нерва 22}, использовался для размещения пуансона ткани на всю толщину диаметром 8 мм, сосредоточенного на ямке. На сайт были загружены ОКТ-сканирование через фовеальный центр и участок на 2 мм выше, соответствующий гистологии на тех же уровнях, а также цветная фотография глазного дна. Выбор плоскостей ОКТ был продиктован выпуклостью патологии ВМД под ямкой²³ и выпуклостью SDD в богатых палочками участках, превосходящих ямку^24,25.

Начиная с 2013 года, глаза, визуализированные с помощью ОКТ-анкордированной MMI в течение жизни, были доступны для прямых клинико-патологических корреляций. Большинство (7 из 10 доноров) включали пациентов в реферальную практику сетчатки (автор: K.B.F.), которая предлагала расширенный директивный реестр для пациентов, заинтересованных в пожертвовании своих глаз после смерти для исследовательских целей. Глаза были извлечены и сохранены местным глазным банком, переданы в лабораторию и подготовлены так же, как глаза проекта MACULA. Предсмертные клинические тома ОКТ были легко счищены в лаборатории, что позволило согласовать признаки патологии, наблюдаемые в течение жизни, с особенностями, наблюдаемыми под микроскопом²⁶.

Начиная с 2014 года, проспективный сбор глаз начинался с скрининга на ВМД в донорских глазах без клинического анамнеза, но сохраненных в течение определенного периода времени (6 часов). Для этого держатель для глаз был модифицирован для размещения целого глобуса. Это уменьшило вероятность отрыва по срезанным кромкам ранее использовавшегося 8-мм пуансона. Глаза консервировали в 4% буферном параформальдегиде для иммуногистохимии и переводили на 1% на следующий день для длительного хранения. В 2016-2017 гг. (до пандемии) было восстановлено 184 глаза от 90 доноров. Статистика и изображения в этом отчете взяты из этой серии. В эпоху пандемии (блокировки и последствия 2020 года) перспективные коллекции для транскриптомики и сотрудничества IMS продолжались более медленными темпами, в основном с использованием методов 2014 года.

Существуют и другие методы оценки донорского глаза. Миннесотская система оценок (MGS)^27,28 основана на клинической системе AREDS для цветной фотографии глазного дна ²⁹. К ограничениям этого метода относится объединение атрофической и неоваскулярной ВМД в одну стадию «поздней ВМД». Кроме того, MGS влечет за собой удаление нейросенсорной сетчатки перед фотодокументацией сосудистой оболочки RPE. Этот шаг в разной степени смещает SDD ^30,31 и удаляет пространственное соответствие наружной сетчатки и ее поддерживающей системы. Таким образом, усилия по установлению связи метаболического спроса и передачи сигналов от сетчатки к патологии в РПЭ-сосудистой оболочке могут быть затруднены. Система штата Юта внедрила MMI с использованием цветной фотографии ex vivo и ОКТ для категоризации глаз, предназначенных для вскрытия, на области для экстракции РНК и белка³². Несмотря на то, что это предпочтительнее удаления целого наглазника, площадь диаметром 3 мм с наибольшим риском прогрессирования ВМД^33,34 составляет только 25% от пуансона диаметром 6 мм, ориентированного на ямку. Таким образом, методы, которые могут локализовать результаты в отношении ямки, такие как серийное сечение для иммуногистохимии, являются преимущественными.