단백질 결정학을 위한 결정 적중을 얻기 위한 고처리량 스크리닝

1. 16 개의 96 웰 깊은 우물 블록을위한 칵테일 준비 또는 구매 96웰 깊은 우물(DW) 블록에 분주하여 사내에서 생성된 화학 칵테일을 준비합니다. 로봇 액체 처리기를 사용하여 소금, 완충액, 폴리머 및 물의 저장 용액을 분배하고 혼합합니다. 로봇 식 액체 처리기 또는 멀티 채널 피펫을 사용하여 사내에서 수정 된 화학 칵테일을 준비하여 상업적으로 구매 한 96 웰 DW 블록 스크린에 추가 구성 요소를 추가합니다. 시중에서 판매되는 DW 블록을 구입합니다. 라벨이 부착된 96웰 DW 블록을 -20°C에서 12-18개월 동안 보관합니다.참고: 1.1단계에서 준비한 칵테일. 및 1.2. 10/16 96웰 DW 블록을 채우고 5/16 96웰 DW 블록을 구매 시 사용합니다. 첨가제 스크린의 침전을 방지하기 위해 1,536웰 플레이트 디스펜싱 시 스크린에 하나의 96웰 DW 블록이 설정됩니다(섹션 3 참조). 2. 칵테일을 384웰 플레이트에 분배 96웰 DW 블록을 4°C에서 밤새 해동합니다. 384웰 플레이트 준비를 시작하기 전에 실온(20-23°C)으로 가져옵니다.알림: 실온은 칵테일 플레이트를 준비하는 데 적합합니다. 이러한 플레이트를 준비할 때 가장 중요한 것은 액체 처리 장치를 막히게 하고 칵테일 성분의 농도에 예측할 수 없는 변화를 일으킬 수 있는 침전물을 피하는 것입니다. 잔류성 불투명 침전물을 용해시키기 위해 필요에 따라 반전으로 블록을 완전히 혼합합니다. 우물에 침전물이 포함되어 있으면 블록을 30°C로 따뜻하게 하여 용해시킵니다. 96 주사기 또는 피펫 헤드가 장착된 액체 처리 로봇을 사용하여 4개의 96웰 DW 블록에서 1개의 384웰 플레이트로 50μL의 칵테일 용액을 전달합니다. 4개의 96웰 DW 블록은 사분면이 채워지도록 384웰 플레이트에 스탬핑됩니다(예: 96-DW1의 A1 내지 384-플레이트1의 A1, 96-DW2의 A1 내지 384-플레이트1의 B1 등) (그림 3). 16개의 96웰 DW 블록 중 15개를 384웰 플레이트에 전달하여 보관할 수 있습니다. 384웰 플레이트를 -20°C에서 최대 6개월 동안 보관하여 1,536웰 플레이트를 준비하는 데 사용합니다. 3. 오일 및 결정화 칵테일로 1,536웰 플레이트 준비 느린 흡인 및 전달 능력을 갖춘 로봇 액체 처리 시스템을 사용하여 1,536웰 플레이트의 각 웰에 5μL의 파라핀 오일을 전달합니다. 오일 플레이트를 4°C에서 최대 6개월 동안 보관하십시오. 섹션 2의 384웰 플레이트를 4°C에서 밤새 해동합니다. 플레이트를 뒤집어 용액을 혼합하고 침전물을 용해시킵니다. 플레이트를 30°C에서 인큐베이션하여 잔류성 침전물을 용해시킨다. 첨가제 스크리닝 성분을 준비하기 위해, 0.1 M HEPES pH 6.8, 30% PEG3350을 함유하는 최종 96-웰 DW 블록을 사용하여 액체 취급 로봇 또는 멀티채널 피펫을 사용하여 상용 첨가제 스크린과 혼합한다. 3.3단계에서 제조된 완충된 PEG3350 용액과 첨가제 스크린의 1:1 혼합물을 적절한 384웰 플레이트에 최종 부피 50μL로 분주하여 첨가제 스크린 용액을 준비합니다. 384 주사기 또는 피펫 헤드가 장착된 액체 처리 로봇을 사용하여 200nL의 칵테일 용액을 1,536웰 플레이트의 각 웰에 전달합니다. 사분면이 채워지도록 4개의 384웰 플레이트를 1,536웰 플레이트에 스탬핑합니다(예: 384-플레이트1의 A1 내지 1,536-웰 플레이트의 A1, 384-플레이트1의 A2 내지 1,536-웰 플레이트의 A3 등). (그림 3). 플레이트를 150 × g 에서 5분 동안 원심분리한 후 4°C에서 최대 4주 동안 보관합니다. 4. 샘플 제출 샘플을 제출하려면 다가오는 상영 실행에 대한 예약 마감일 전에 예약 이메일을 보내십시오. 스크리닝 실험 횟수, 이름, PI 및 기관뿐만 아니라 샘플에 대한 특별한 취급 요구 사항을 포함합니다. 스크리닝 실행은 약 한 달에 한 번 수행되므로 연간 12회 실행됩니다. 샘플을 배송하기 전에 샘플 제출 양식을 작성하십시오.새 사용자의 경우 섹션 7의 결정화 이미지를 다운로드하는 데 사용할 암호를 선택합니다. 설정된 사용자의 경우 기존 암호를 사용하거나 이 단계에서 암호를 변경합니다. 1.5mL 튜브에 샘플을 제출합니다. 거대분자가 균질하고 결정화를 촉진하기 위해 적절하게 농축되었는지 확인합니다. 일반적으로 황산 암모늄 또는 PEG 4,000으로 구성된 사전 결정화 테스트를 사용하여 테스트 된 샘플 농도가 명확한 방울 또는 침전물34를 초래하는지 관찰하여 적절한 샘플 농도를 조사하십시오.참고: 순도와 균질성을 확인하기 위해 샘플을 제출하기 전에 수행할 수 있는 적절한 품질 테스트에는 SDS-PAGE, 겔 여과 및 동적 광 산란(DLS) 등이 포함됩니다. 결정화는 심지어 작은 불순물의 존재에 의해 영향을받을 수 있습니다. 현재 1,536웰 플레이트 1개를 설정하려면 500μL의 시료량이 필요합니다. 샘플 부피 요구 사항을 줄이기 위한 테스트가 진행 중입니다.50mM보다 큰 버퍼 농도와 스크린 내에서 결정화될 수 있는 인산염을 사용하지 마십시오. 글리세롤 농도가 10% w/v를 초과하는 과도한 가용화제를 피하십시오. 밀봉된 용기에 드라이아이스, 웨트아이스 또는 냉각 팩을 사용하여 적절한 온도를 안전하게 유지하기 위해 샘플을 포장합니다. 실행 중 월요일-수요일에 밤새 샘플 우선 순위를 배송합니다. 샘플이 배송되면 추적 번호를 이메일로 보내주십시오. 5. 준비된 1,536웰 플레이트에서 샘플 설정 시료의 포장을 풀고 사용자가 요청한 온도에서 즉시 배양합니다. 해동되면 샘플을 10,000× g 에서 실온에서 2분 동안 원심분리합니다. 샘플을 육안으로 관찰하여 침전, 색상 및 설정 전에 샘플의 상태를 식별합니다. 1,536-웰 플레이트를 23°C로 예열하고 150 × g 에서 5분 동안 원심분리한다. 명시야 이미징을 음성 대조군으로 사용하여 칵테일 전용 플레이트를 이미지화합니다.참고: 모든 플레이트는 샘플 설정 전에 명시야 이미징으로 이미지화되며, 이를 통해 샘플 전에 이미 결정 또는 파편이 있는 웰을 식별할 수 있습니다.amp음성 대조군으로 추가합니다. 또한, 결정화 칵테일이 전달 되지 않은 웰을 식별할 수 있습니다. 플레이트를 실온으로 예열하면 플레이트 표면의 응결이 제거되어 선명한 이미지를 얻을 수 있습니다. 액체 처리 로봇을 사용하여 1,536웰 플레이트의 각 웰에 200nL의 시료를 분주합니다. 플레이트를 150 × g 에서 원심분리하고 플레이트를 4°C, 14°C, 또는 23°C에서 배양합니다.참고: Microbatch 언더오일 실험은 원하는 오일 아래에 단백질과 칵테일을 분배하여 손으로 설정할 수 있습니다. 그러나 재현 가능한 결과를 얻으려면 각 단백질과 칵테일을 1μL 이상 사용하는 것이 좋습니다. 6. 결정 형성을 위한 1,536웰 플레이트 모니터링 샘플을 1,536웰 플레이트에 추가한 후 1일차와 1주차, 2주차, 3주차, 4주차, 6주차에 명시야 이미징으로 이미지를 촬영합니다. 23°C에서 배양되는 플레이트의 경우 4주 시점에서, 14°C 또는 4°C에서 배양되는 플레이트의 경우 6주 시점에서 SHG 및 UV-TPEF를 사용하여 SONICC 이미징을 수행합니다.참고: SONICC 이미징의 타이밍은 일반적으로 해당 시점에 결정이 나타나기 때문에 고처리량 1,536 미세 분석 플레이트의 경우 4주 및 6주 시점으로 예정되어 있습니다. 오일 또는 증기 확산 실험에서 96웰 마이크로 배치로 수정하려면 시간 창에서 더 일찍 SONICC 이미징을 수행하는 것이 좋습니다. 내부 LIMS 시스템을 사용하여 사용자 계정으로 자동 전송된 실험 이미지에 액세스합니다. 자동화된 htslab 이메일 데몬을 통해 사용자에게 이미징이 발생했음을 알립니다. 7. 이미지 분석 HWI ftp 사이트에서 각 .rar 파일에 대한 스크리닝 이미지를 검색합니다.참고: 1,536 화면의 이미지 출력으로 인해 명시야 이미지, SHG 이미지 및 UV-TPEF 이미지가 포함된 여러 파일이 생성됩니다. 각 이미징 형식 또는 시점은 별도의 .rar 파일입니다. 각 .rar 파일은 압축을 풀었을 때 특정 이미징 방식을 사용하여 특정 시점에서 1,536웰 플레이트의 각 웰에서 얻은 이미지를 포함합니다.FileZilla 클라이언트 또는 기타 옵션을 사용하여 ftp 데이터에 액세스합니다.참고: FileZilla 클라이언트는 계산 충돌을 최소화하기 위해 대용량 파일 전송 볼륨을 관리하는 데 권장되는 방법입니다.FileZilla 클라이언트를 사용자 컴퓨터에 설치해야 하는 경우 FileZilla 소프트웨어를 다운로드합니다. FileZilla Client가 이미 설치되어 있거나 설치시 FileZilla 아이콘을 클릭하여 소프트웨어를 엽니 다. 호스트 ftp 웹 사이트, 사용자 이름 및 암호를 입력하여 FileZilla에서 원격 ftp 서버에 로그인합니다. 원하는 디렉토리에 .rar 파일을 다운로드합니다. AI 지원 오픈 소스 GUI를 사용하여 결정화 이미지를 보고, 점수를 매기고, 분석할 수 있습니다.참고: GUI는 대부분의 Windows, Mac 및 Linux 운영 체제(OS)에서 사용할 수 있으며 OS별 다운로드 지침은 GitHub 사이트에 있습니다. MARCO Polo는 HTX Center에서 구현된 고처리량 1,536 결정화 화면의 메타데이터를 통합하는 오픈 소스 GUI입니다. 누구나 GitHub에서 다운로드하여 다른 실험실 그룹의 특정 요구 사항을 반영하도록 수정할 수 있습니다.파일을 다운로드한 후 GUI에서 .rar 파일을 엽니다( 보충 그림 S1 참조).Import( 가져오기)를 클릭하고 드롭다운 메뉴에서 Images(이미지 )를 선택한 다음 From Rar Archive/Directory(Rar 아카이브/디렉터리에서)를 선택합니다. 팝업 창에서 Browse for Folder(폴더 찾아보기 )를 클릭한 다음 이미지가 포함된 폴더로 이동합니다. 원하는 파일을 선택하고 열기를 클릭하여 GUI로 가져옵니다. 선택한 경로 창에 파일이 나타날 때까지 기다립니다. GUI에 다운로드할 파일을 하나 이상 선택하고 Import Runs(실행 가져오기)를 클릭합니다. 샘플 이름 왼쪽에 있는 > 기호를 클릭한 다음 두 번 클릭하여 적절한 읽기를 선택하여 GUI의 슬라이드쇼 뷰어 창에서 첫 번째 웰의 이미지를 봅니다(읽기는 이미지 명시야, UV-TPEF 또는 SHG의 날짜 및 유형별로 나열됨). 전체 창의 크기를 조정하여 이미지를 확대합니다. 이미지 세부 정보 상자에는 점수 매기기 정보(읽기가 채점될 때까지 비어 있음)를 포함하여 이미지에 대한 정보가 포함됩니다. 칵테일 세부 정보 상자에는 칵테일 구성 요소에 대한 메타데이터가 포함되어 있습니다. 탐색 패널에서 다음 버튼을 클릭하거나 키보드에서 오른쪽 화살표 키를 눌러 다음 웰로 이동합니다. 웰 번호별(By Well Number) 창에 웰 번호를 입력하여 특정 웰로 이동합니다. Show All Dates(모든 날짜 표시) 상자를 선택하여 GUI로 가져온 모든 읽기를 봅니다. Show All Spectra 상자를 선택하여 GUI로 가져온 모든 스펙트럼을 봅니다. 스펙트럼 스왑 버튼을 클릭하면 각 스펙트럼 이미지를 개별적으로 볼 수 있습니다. MARCO 알고리즘을 사용하여 먼저 창 왼쪽의 목록에서 특정 실행을 강조 표시하여 수정 이미지의 점수를 매깁니다. 그런 다음 선택한 실행 분류 버튼을 클릭합니다. 모든 1,536개의 웰에 대해 이미징 판독값이 점수가 매겨지면 이미지 세부 정보 창에서 MARCO 점수 정보를 봅니다.참고: 분류는 일반적으로 컴퓨터 속도와 사용 가능한 메모리에 따라 2-5분 정도 걸립니다. 이 알고리즘은 콘텐츠를 “crystal”, “clear”, “precipitate” 또는 “other” 클래스로 분류하는 점수를 생성합니다. 각 웰의 분류와 연관된 숫자 값은 해당 클래스의 오브젝트를 포함하는 웰의 가능성을 반영합니다.Image Filtering 패널에서 원하는 상자를 선택하고 Submit Filters 버튼을 클릭하여 점수가 매겨진 이미지의 하위 집합을 봅니다. 예를 들어, 크리스탈 및 MARCO 상자를 선택하고 필터 제출을 클릭하여 MARCO에서 크리스탈로 분류한 이미지만 볼 수 있습니다. 크리스탈 이미지를 수동으로 채점하여 “인간 점수” 세트를 생성합니다. 적절한 버튼을 클릭하여 우물에 점수를 할당합니다(“크리스탈”, “클리어”, “침전” 또는 “기타” 버튼은 창 하단의 분류 패널에 있음). 또는 키보드의 숫자 패드를 사용하여 점수를 할당합니다(1 = “crystal”, 2 = “clear”, 3 = “precipitate”, 4 = “other”). 즐겨찾기 를 선택하여 사람이 점수를 매긴 이미지를 “즐겨찾기”로 지정하시겠습니까?상자.참고: Crystals and the Human 상자를 선택하고 Submit Filters(필터 제출)를 클릭하여 인간이 크리스탈로 분류한 이미지만 봅니다. 필터링 패널에서 즐겨찾기 상자를 클릭하면 반환된 이미지의 범위가 더 좁혀지고 즐겨찾기이기도 한 사람이 점수를 매긴 크리스탈 이미지만 반환됩니다. 플레이트 뷰어 탭을 사용하여 한 번에 여러 웰을 볼 수 있습니다. 컨트롤 패널의 두 번째 플레이트 뷰어 탭에 있는 플레이트당 이미지 섹션의 드롭다운 메뉴에서 16개, 64개 또는 96개의 이미지를 선택합니다. 이미지 필터링 탭을 사용하여 관심 없는 이미지를 회색으로 표시합니다. 필터 적용 상자를 선택하여 이미지를 필터링합니다.참고: 예를 들어ample, “인간” 및 “수정” 상자를 선택하면 인간이 수정으로 채점한 우물만 쉽게 볼 수 있습니다.플레이트 뷰어 탭에서 다음 버튼을 클릭하여 다음 16/64/96 이미지 세트를 봅니다. 기본적으로 크리스탈로 점수가 매겨진 이미지는 빨간색, 투명으로 점수가 매겨진 이미지는 파란색, 침전물로 점수가 매겨진 이미지는 녹색, 다른 것으로 점수가 매겨진 이미지는 주황색입니다. 드롭다운 메뉴를 사용하여 색상을 변경합니다. 레이블 탭에서 다양한 상자를 선택하여 웰에 표시할 정보를 선택합니다. Save View(뷰 저장)를 클릭하여 현재 뷰의 이미지 파일을 저장합니다. 스펙트럼 스왑(Swap Spectrum)을 클릭하여 다중 웰 이미지에 대한 명시야, SHG 및 UV-TPEF 이미지 간에 전환합니다. 내보내기를 클릭하고 드롭다운 메뉴에서 적절한 파일 형식을 선택하여 다른 프로그램에서 사용할 수 있도록 점수가 매겨진 파일을 내보냅니다.참고: CSV(쉼표로 구분된 값) 파일은 Microsoft Excel 또는 Google 스프레드시트와 같은 스프레드시트 프로그램과 호환됩니다. JSON(JavaScript Object Notation) 파일은 대부분의 텍스트 편집기에서 열 수 있습니다. PPTX(PowerPoint 프레젠테이션)를 사용하여 명시야, UV-TPEF 및 SHG 이미지의 비교를 포함하여 Polo의 이미지를 표시할 수 있습니다. 파일은 MARCO Polo GUI에서 다시 열 수 있도록 .xtal 형식으로 저장됩니다.페이지 상단의 File(파일)을 클릭한 다음 Save Run(실행 저장) 또는 Save Run As(다른 이름으로 실행 저장)를 선택하여 .xtal 형식 파일을 저장합니다. 파일 이름 및 디렉터리 위치를 제공합니다. Import(가져오기)를 클릭하고 Images(이미지)를 선택한 다음 From Saved Run(저장된 실행에서)을 선택하여 .xtal 형식 파일을 엽니다. 적절한 파일 위치를 찾아 파일 이름을 클릭한 다음 열기를 클릭합니다.