高通量筛选以获得用于蛋白质晶体学的晶体命中

1. 为16个96孔深井块准备或购买鸡尾酒 通过将分液到 96 孔深井 （DW） 块中来制备内部生成的化学混合物。使用机器人液体处理器分配和混合盐、缓冲液、聚合物和水的储备溶液。 使用机器人液体处理器或多通道移液器制备内部改性化学混合物，将其他组件添加到已商业购买的 96 孔 DW 块筛中。 购买市售的 DW 块。 将标记的96孔DW块在-20°C下储存12-18个月。注意：在步骤1.1中准备的鸡尾酒。和 1.2.填充 10/16 96 孔 DW 模块，并使用购买的 5/16 96 孔 DW 模块。在1，536孔板分液时，在筛网中设置一个96孔DW模块，以避免添加剂筛沉淀（参见第3节）。 2. 将鸡尾酒分配到 384 孔板中 将96孔DW块在4°C下解冻过夜。在开始制备384孔板之前，将其置于室温（20-23°C）。注意：室温适合准备鸡尾酒盘。制备这些板的主要问题是避免沉淀物，沉淀物会堵塞液体处理设备并导致鸡尾酒成分浓度的不可预测的变化。 根据需要通过倒置彻底混合块，以溶解任何持久的不透明沉淀物。如果任何孔含有沉淀物，请将块加热至30°C溶解。 使用配备 96 注射器或移液器头的液体处理机器人将来自四个 96 孔 DW 模块的 50 μL 鸡尾酒溶液输送到一个 384 孔板中。将四个 96 孔 DW 模块冲压到 384 孔板中，以便填充象限（例如，96-DW1 的 A1 到 384 板的 A1，96-DW2 的 A1 到 384 板的 B1 等）（图3）。 将 16 个 96 孔 DW 模块中的 15 个输送到 384 孔板进行存储。 将384孔板在-20°C下储存长达6个月，用于制备1，536孔板。 3. 用油和结晶混合物制备 1，536 孔板 使用具有缓慢抽吸和输送能力的机器人液体处理系统将 5 μL 石蜡油输送到 1，536 孔板的每个孔中。将油板在4°C下储存长达6个月。 将第2节的384孔板在4°C下解冻过夜。倒置板以混合溶液并溶解沉淀物。将板在30°C孵育以溶解持久性沉淀物。 为了制备添加剂筛选组件，请使用含有0.1 M HEPES pH 6.8，30%PEG3350的最终96孔DW模块，通过使用液体处理机器人或多通道移液器与商业添加剂筛选混合。 通过在适当的384孔板中将步骤3.3中制备的缓冲PEG3350溶液和添加剂筛选的1：1混合物分配至最终体积为50μL来制备添加剂筛选溶液。 使用配备 384 注射器或移液器头的液体处理机器人将 200 nL 的鸡尾酒溶液输送到 1，536 孔板的每个孔中。将四个 384 孔板压入 1，536 孔板中，以便填充象限（例如，1，536 孔板的 384 板 A1 至 A1，384 孔板的 A2 至 A3，1，536 孔板的 A2 等）（图3）。 将板以150 ×g 离心5分钟，然后在4°C下储存长达4周。 4. 样品提交 要提交样品，请在即将进行的筛选运行的预订截止日期之前发送预订电子邮件。包括筛选实验的数量、名称、PI 和机构，以及样品的任何特殊处理要求。筛查运行大约每月进行一次，每年运行 12 次。 在运送样品之前填写样品提交表格。对于新用户，请选择一个 密码 ，该密码将用于下载第 7 节中的结晶图像。 对于已建立的用户，请使用现有密码或在此步骤中更改 密码 。 将样品提交到 1.5 mL 管中。确保大分子均匀且充分浓缩以促进结晶。使用通常由硫酸铵或PEG 4，000组成的预结晶测试，通过观察测试的样品浓度是否导致清晰的液滴或沉淀34来研究适当的样品浓度。注意：在提交样品之前可以进行适当的质量测试以检查纯度和均匀性，包括SDS-PAGE，凝胶过滤和动态光散射（DLS）等。即使是微小杂质的存在也会影响结晶。目前需要 500 μL 的样品体积来设置一个 1，536 孔板。测试正在进行中，以减少样品量要求。避免使用大于50 mM的缓冲液浓度以及可能在筛网内结晶的磷酸盐。 避免使用过量的增溶剂，包括甘油浓度大于10%w/v。 使用干冰、湿冰或密封容器中的冷却包包装样品以安全地保持适当的温度。 在运行期间的周一至周三隔夜运送样品优先权。 样品发货后，通过电子邮件发送跟踪号。 5. 准备好的 1，536 孔板中的样品设置 打开样品包装并立即在用户要求的温度下孵育。 解冻后，在室温下以10，000× g 离心样品2分钟。在设置之前目视观察样品，以确定样品的沉淀、颜色和状况。 将1，536孔板加热至23°C，并以150 ×g 离心5分钟。使用明场成像作为阴性对照对仅鸡尾酒板进行成像。注意：在样品设置之前，所有板都使用明场成像成像，这使得在添加样品作为阴性对照之前能够识别其中已经有晶体或碎片的孔。此外，它能够识别 尚未 交付结晶混合物的井。将板加热至室温可消除板表面的冷凝，从而获得清晰的图像。 使用液体处理机器人将 200 nL 样品分配到 1，536 孔板中的每个孔中。以150× g 离心板，并在4°C，14°C或23°C下孵育板。注意：微量油下实验可以通过将蛋白质和混合物分配到所需油下来手动设置。但是，建议使用不少于1 μL的每种蛋白质和混合物，以获得可重复的结果。 6. 监测 1，536 孔板的晶体形成 将样品添加到 1，536 孔板后，在第 1 天和第 1 周、第 2 周、第 3 周、第 4 周和第 6 周使用明场成像成像。 对于在23°C孵育的板，在4周时间点和在14°C或4°C孵育的板的6周时间点使用SHG和UV-TPEF进行SONICC成像。注意：SONICC成像的时间安排在高通量1，536显微测定板的4周和6周时间点，因为通常，晶体会在这些时间点出现。为了在油或蒸汽扩散实验下对96孔微批次进行修改，建议在时间窗口的早期进行SONICC成像。 访问已使用内部LIMS系统自动传输到用户帐户的实验图像。通过自动 htslab 电子邮件守护程序 通知 用户已发生映像。 7. 图像分析 从 HWI ftp 站点检索每个.rar文件的放映图像。注意： 从 1，536 屏幕输出的图像会产生许多包含明场图像、SHG 图像和 UV-TPEF 图像的文件。每个成像模式或时间点都是一个单独的.rar文件。解压缩后，每个.rar文件都包含使用特定成像模式在特定时间点的 1，536 孔板的每个孔的图像。使用 FileZilla 客户端或其他选项访问 ftp 数据。注意：建议使用 FileZilla 客户端来管理大型文件传输量，以最大程度地减少计算崩溃。如果需要在用户计算机上安装 FileZilla 客户端，请下载 FileZilla 软件。 如果 FileZilla 客户端已安装或在安装时，请单击 FileZilla 图标 以打开软件。 通过输入主机 ftp 网站、用户名和密码从 FileZilla 登录到远程 ftp 服务器。 将.rar文件下载到所需的目录。 使用 AI 支持的开源 GUI 查看、评分和分析结晶图像。注意：GUI 可以在大多数 Windows、Mac 和 Linux 操作系统 （OS） 上使用，特定于操作系统的下载说明位于 GitHub 站点上。MARCO Polo 是一个开源 GUI，它整合了来自 HTX 中心实施的高通量 1，536 结晶屏幕的元数据。任何人都可以从 GitHub 下载它进行修改，以反映其他实验室组的特定需求。下载.rar文件后，在 GUI 中打开该文件（请参阅 补充图 S1）。单击 导入，从下拉菜单中选择 图像 ，然后选择 从 Rar 存档/目录。 单击弹出窗口中的 “浏览 文件夹”，然后导航到包含图像的文件夹。 选择所需的文件，然后单击“ 打开”导入到 GUI 中。等待文件出现在 “所选路径 ”窗口中。选择要下载到 GUI 中的一个或多个文件，然后单击导入 运行。 在GUI的 幻灯片查看器 窗口中查看第一个孔的图像，方法是单击样品名称左侧的 > 符号，然后双击它来选择适当的读数（读数按图像明场，UV-TPEF或SHG的日期和类型列出）。 通过调整整个窗口的大小来放大图像。“图像详细信息”框包含有关 图像 的信息，包括评分信息（在读取评分之前为空）。“鸡尾酒详细信息”框包含有关 鸡尾酒 组件的元数据。 通过单击导航面板中的“下一步”按钮或按键盘上的向右箭头键移动到下一个井。通过在“按井号”窗口中输入井号导航到特定井。 通过选中“ 显示所有日期 ”框来查看所有读数（导入到 GUI 中的读数）。 通过选中“显示所有光谱”框来查看 所有光谱 （导入到 GUI 中的光谱）。单击交换频谱按钮可单独查看每个 频谱 图像。 使用 MARCO 算法对晶体图像进行评分，方法是首先从窗口左侧的列表中突出显示特定运行。接下来，单击“ 分类选定的运行 ”按钮。在所有 1，536 孔的成像读数评分后，在 “图像详细信息 ”窗口中查看 MARCO 评分信息。注：分类通常需要 2-5 分钟，具体取决于计算机速度和可用内存。该算法生成的分数将内容分类为“晶体”、“清除”、“沉淀”或“其他”类。与每个井的分类相关联的数值反映了井包含该类对象的可能性。通过在 “图像过滤 ”面板中勾选所需的框并单击“ 提交过滤器 ”按钮，查看评分图像的子集。例如，仅查看被MARCO分类为水晶的图像，方法是勾选 水晶 和 MARCO 框，然后单击 提交过滤器。 手动对晶体图像进行评分以生成“人类评分”集。通过单击相应的按钮为井分配分数（“晶体”、“清除”、“沉淀”或“其他”按钮位于窗口底部的 分类 面板中）。或者，使用键盘上的数字键盘分配分数（1 = “水晶”，2 = “清除”，3 = “沉淀”，4 = “其他”）。通过勾选收藏夹将人工评分的图像指定为“收藏 夹”？ 箱。注意：仅查看被人类分类为水晶的图像，方法是勾选水晶和人体框，然后单击提交过滤器。单击“过滤”面板中的“收藏夹”框可进一步缩小返回的图像范围，仅返回也是收藏夹的人工评分水晶图像。 使用“板查看器”选项卡一次查看多个孔。在“控制面板”的第二个“印版查看器”选项卡上，从“每个印版的图像”部分的下拉菜单中选择 16、64 或 96 张图像。 使用“图像过滤”选项卡可将不感兴趣的图像灰化。选择“应用筛选器”框以筛选图像。注意：例如，选择“人类”和“水晶”框，只有那些被人类评分为水晶的井才容易看到。在“ 板查看器 ”选项卡中导航，方法是单击 “下一步 ”按钮以查看下一组 16/64/96 图像。默认情况下，计分为晶体的图像为红色，计分为清晰的影像为蓝色，计分为沉淀的图像为绿色，计分为其他的图像为橙色。使用下拉菜单更改颜色。 通过勾选 标签选项卡上的各个 框来选择要显示在孔上的信息。 单击“保存视图”以 保存当前视图 的图像文件。 单击交换 光谱 以在明场、SHG 和 UV-TPEF 图像之间切换多孔图像。 单击导出，然后从下拉菜单中选择适当的文件类型以导出评分文件以用于其他程序。注意：CSV（逗号分隔值）文件与电子表格程序（如 Microsoft Excel 或 Google 表格）兼容。JSON（JavaScript Object Notation）文件可以用大多数文本编辑器打开。PPTX（PowerPoint 演示文稿）可用于显示来自 Polo 的图像，包括明场、UV-TPEF 和 SHG 图像的比较。文件以.xtal格式保存，以便在马可波罗GUI中重新打开。通过单击页面顶部的“文件”，然后选择“保存运行”或“将运行另存为”来保存 .xtal 格式的文件。提供文件名和目录位置。 打开 .xtal 格式文件，方法是单击“ 导入 ”并选择“ 图像 ”，然后选择 “从保存的运行”。浏览相应的文件位置，单击文件名，然后单击“ 打开”。