使用设计的混合工艺实验和自验证集成模型 （SVEM） 优化脂质纳米颗粒 （LNP） 配方的工作流程

用于体内基因递送系统的脂质纳米颗粒（LNP）制剂通常涉及来自可电离脂质、辅助脂质和PEG脂质¹，^2，3类别的四种组成脂质。无论这些脂质是单独研究还是与其他非混合因子同时研究，这些配方的实验都需要“混合物”设计，因为 – 给定候选配方 – 增加或减少任何一种脂质的比例必然导致其他三种脂质的比例之和相应减少或增加。

为了说明这一点，假设我们正在优化LNP配方，该配方目前使用将被视为基准的固定配方。目标是最大限度地提高LNP的效力，其次是最小化平均粒径。实验中变化的研究因素是四种组成脂质（可电离、胆固醇、涂料、PEG）的摩尔比、N：P 比、流速和可电离脂质类型。可电离和辅助脂质（包括胆固醇）允许在比PEG更宽的摩尔比范围内变化，10-60%，在本图中将在1-5%之间变化。基准配方配方和其他因素的范围及其舍入粒度在补充文件 1 中指定。在这个例子中，科学家们能够在一天内进行23次运行（独特的颗粒批次），如果满足最低要求，他们希望将其用作样本量。该实验的模拟结果在补充文件2和补充文件3中提供。

Rampado和Peer⁴最近发表了一篇关于优化纳米颗粒药物输送系统的设计实验的综述论文。Kauffman等人⁵考虑了使用分数阶乘和确定性筛选设计进行LNP优化研究⁶;然而，如果不使用低效的“松弛变量”7，这些类型的设计就无法适应混合约束，并且^{通常在存在混合}因子时不使用^7，8。相反，能够包含混合约束的“最佳设计”传统上用于混合过程实验⁹。这些设计针对研究因子的用户指定函数，并且仅当该函数捕获研究因子和响应之间的真实关系时，这些设计才是最优的（在多种可能意义上的一种）。请注意，案文中对“最佳设计”和“最佳候选配方”有区别，后者是指由统计模型确定的最佳配方。对于混合过程实验，优化设计有三个主要缺点。首先，如果科学家在指定目标模型时未能预测研究因素的相互作用，那么得到的模型将是有偏差的，并可能产生较差的候选公式。其次，最优设计将大部分游程置于因子空间的外部边界上。在LNP研究中，如果颗粒在脂质或工艺设置的任何极端情况下没有正确形成，这可能会导致大量的运行损失。第三，科学家通常更喜欢在因子空间的内部进行实验运行，以获得与模型无关的响应面感，并直接在因子空间的先前未探索的区域观察该过程。

另一种设计原则是使用空间填充设计¹⁰来针对（混合约束）因子空间的近似均匀覆盖。相对于最优设计⁹ ，这些设计牺牲了一些实验效率（假设整个因子空间导致有效的公式），但在权衡中提供了一些好处，这些好处在本应用中很有用。空间填充设计不对响应面的结构做出任何 先验 假设;这使其能够灵活地捕获研究因素之间的意外关系。这也简化了设计生成，因为它不需要在调整所需的运行大小时决定添加或删除哪些回归项。当某些设计点（配方）导致公式失败时，空间填充设计可以对研究因子的失效边界进行建模，同时还支持成功因子组合上研究响应的统计模型。最后，因子空间的内部覆盖允许对响应面进行独立于模型的图形探索。

为了可视化混合过程实验的混合因子子空间，使用了专门的三角形“三元图”。 图 1 激发了这种用法：在允许三个成分范围从 0 到 1 的点立方体中，满足成分总和等于 1 的约束的点以红色突出显示。对三种成分的混合约束将可行因子空间减小为三角形。在具有四种混合物成分的LNP应用中，我们通过一次绘制两种脂质与代表其他脂质之和的“其他”轴来生成六种不同的三元图来表示因子空间。

图 1：三角因子区域。 在立方体内的空间填充图中，灰色小点表示与混合约束不一致的配方。较大的红点位于立方体内的三角形上，表示满足混合约束的公式。 请点击此处查看此图的大图。

除了脂质混合物因子外，通常还有一个或多个连续的过程因子，例如N：P比，缓冲液浓度或流速。可能存在分类因子，例如可电离脂质类型、辅助性脂质类型或缓冲液类型。目标是在 体内 研究中找到一种配方（脂质和过程因子设置的混合物），以最大限度地提高某种效力和/或改善理化特性，例如最小化粒径和PDI（多分散指数），最大化包封百分比，并最大限度地减少副作用 – 例如体重减轻。即使从合理的基准配方开始，鉴于遗传有效载荷的变化或考虑过程因素或脂质类型的变化，也可能有兴趣重新优化。

康奈尔7提供了关于混合物和混合物过程实验的统计方面的权威文本，Myers等人⁹提供了最相关的混合物设计和优化分析主题的出色总结。然而，这些工作可能会使科学家负担过重的统计细节和专业术语。用于实验设计和分析的现代软件提供了一个强大的解决方案，可以充分支持大多数LNP优化问题，而不必诉诸相关理论。虽然更复杂或高优先级的研究仍将受益于与统计学家的合作，并可能采用最佳而不是空间填充设计，但我们的目标是提高科学家的舒适度，并鼓励优化LNP配方，而不是诉诸低效的一次单因素（OFAT）测试¹¹或简单地满足规格的第一个配方。

在本文中，介绍了一种利用统计软件优化通用LNP配方问题的工作流程，按照遇到的顺序解决设计和分析问题。事实上，该方法适用于一般优化问题，不限于LNP。 在此过程中，解决了出现的几个常见问题，并根据经验和仿真结果提供了建议¹²。最近开发的自验证集成模型框架（SVEM）¹³ 极大地改进了分析混合过程实验结果的脆弱方法，我们使用这种方法为配方优化提供了简化的策略。虽然工作流程的构建方式一般，可以使用其他软件包进行，但JMP 17 Pro的独特之处在于提供SVEM以及图形汇总工具，我们发现这些工具对于简化混合过程实验的晦涩分析是必要的。因此，协议中还提供了JMP特定的指令。

SVEM采用与传统方法相同的线性回归模型基础，但它允许我们使用前向选择或惩罚选择（Lasso）基本方法避免拟合候选效应的“完整模型”所需的繁琐修改。此外，SWEM提供了改进的“简化模型”拟合，可最大程度地减少合并数据中出现的噪声（过程加分析方差）的可能性。它的工作原理是平均模型^13，14，¹⁵，¹⁶，^17，18 中每次游程的相对重要性后产生的预测模型。SVEM提供了一个用于模拟混合过程实验的框架，该框架比传统的单次回归更容易实施，并且可以产生更高质量的最佳候选配方^12，13。SVEM的数学细节超出了本文的范围，即使是超出相关文献综述的粗略总结也会分散其在本应用中的主要优势：它允许从业者简单，强大和准确的点击运行程序。

所提出的工作流程与药物开发的质量源于设计（QbD）¹⁹ 方法一致²⁰。研究结果将是了解将材料属性和工艺参数与关键质量属性（CQA）联系起来的功能关系²¹。Daniel等人²² 讨论了使用专门用于RNA平台生产的QbD框架：我们的工作流程可以用作该框架内的工具。