포유류의 미토콘드리아 기능을 측정하기 위한 산소 비의존적 분석

1. 복합체 I, 디히드로오로테이트 탈수소효소(DHODH) 및 복합체 V 활성의 활성을 측정하기 위한 증식 분석 증식 분석을 위한 파종 세포참고: 이 프로토콜은 ATCC에서 상업적으로 구입한 인간 골육종 세포주 143B를 사용합니다. 이 세포주는 승인된 IBC(Institutional Biosafety Committee) 프로토콜의 지침에 따라 사용되었습니다.조직 배양 인큐베이터에서 플레이트를 제거합니다. 플레이트에서 배지를 흡인하고 1x 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척하여 남은 배지를 제거합니다. PBS를 흡인하고 접시를 0.05%-0.25% 트립신으로 덮어 플레이트 바닥에서 세포를 들어 올립니다. 트립신이 플레이트에서 세포를 방출할 때까지 3-5분 정도 기다린 다음 10% 소 태아 혈청(FBS)을 포함하는 원하는 성장 배지 10mL로 트립신을 켄칭합니다. 세포를 원뿔형 튜브에 모으고 1,000 × g 에서 5 분 동안 원심 분리하여 세포를 펠렛으로 만듭니다. 펠릿을 방해하지 않고 튜브에서 매체를 흡인합니다. 완전한 매체로 펠릿을 다시 매달아 놓습니다. 세포 수를 세고 6웰 플레이트에서 10,000개에서 25,000개 사이의 세포를 시딩하는 데 필요한 부피를 정량화합니다.참고: 각 세포주는 시드할 세포 수에 맞게 최적화되어야 합니다. 달성된 이상적인 합류점은 실험 시작 시 ~10%, 실험 종료 시 ~80%입니다. 세포를 6-웰 플레이트에 피펫팅하고 2mL의 완전 배지를 웰에 추가합니다. 실험 배지 조건으로 변경하기 전에 24시간 동안 그대로 두십시오.참고: 조건당 최소 3번의 반복을 시드하고 처리되지 않은 대조군 조건, 억제제 처리 대조군 조건, 처리되지 않은 실험 조건 및 억제제 처리 실험 조건을 테스트하기에 충분한 웰을 시드합니다. 증식에 의한 복잡한 V 활성을 평가하기 위한 배지 변화참고: 갈락토오스가 있는 배지에서 증식하는 세포는 ATP 합성을 위한 복합체 V 활성에 의존한다 9,10. 해당과정(glycolysis)을 통해 순 2개의 ATP를 생성하는 포도당과 달리, 갈락토오스는 아무 것도 생성하지 않아 세포가 ATP 합성을 위해 복합체 V에 의존하게 됩니다(그림 1). 복합 V 억제제 올리고마이신이 대조군으로 사용됩니다.10 mM 포도당 함유 배지를 만든다( 표 1 참조). 10 mM 갈락토오스 함유 배지를 만든다( 표 1 참조). 각 웰의 배지를 포도당 함유 DMEM 또는 갈락토오스 함유 DMEM으로 변경합니다. 5μM 올리고마이신(복합체 V 억제제)을 관련 웰에 추가하고 동일한 부피의 DMSO를 처리되지 않은 웰에 추가합니다. 올리고마이신 스톡은 DMSO에 재현탁된 10 mM이다. 플레이트를 다시 조직 배양 인큐베이터에 2일 동안 넣습니다. 증식에 의한 복합체 I 활성을 평가하기 위한 중간 변화참고: 피루브산이 없는 배지에서 증식하는 세포는 복합체 I 활성11,12에 더 의존합니다. 피루브산이 없는 경우, 배양된 세포는 NAD+로의 대부분의 NADH 재산화를 촉진하기 위해 복합체 I이 필요합니다(그림 2). 콤플렉스 I 억제제 로테논이 대조군으로 사용됩니다.10% FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 피루브산이 없는 DMEM 배지를 만듭니다. 피루브산의 1M 용액을 만듭니다( 표 1 참조). 각 웰의 배지를 피루브산이 없는 배지 또는 피루브산 함유 배지로 변경합니다. 처리된 웰에 2μM 로테논(복합체 I 억제제)을 추가하고 처리되지 않은 웰에 동일한 부피의 DMSO를 추가합니다. 로테논 스톡은 DMSO에서 25mM 재현탁됩니다. 플레이트를 다시 조직 배양 인큐베이터에 2일 동안 넣습니다. 증식에 의한 DHODH 활성을 평가하기 위한 중간 변화참고: 우리딘이 없는 배지에서 증식하는 세포는 디히드로오로테이트 탈수소효소(DHODH) 활성11,12,13을 필요로 합니다. 외인성 우리딘이 없는 경우, 배양된 세포는 de novo 경로를 통해 피리미딘을 합성합니다. DHODH 억제제 brequinar가 대조군으로 사용됩니다.10% FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 우리딘이 없는 DMEM을 만듭니다. 10 mg/mL 우리딘 원액을 만든 후, 100 μg/mL 우리딘 배지를 준비한다( 표 1 참조). 각 웰의 배지를 우리딘이 없는 배지 또는 우리딘 함유 배지로 변경합니다. 처리된 웰에 5μM 브레퀴나(DHODH 억제제)를 추가하고 처리되지 않은 웰에 동일한 부피의 DMSO를 추가합니다. 브레퀴나 스톡은 DMSO에서 10mM 재현탁됩니다. 플레이트를 다시 조직 배양 인큐베이터에 2일 동안 넣습니다. 증식 분석을 위한 세포 계수모든 실험에서 2 일마다 배지를 보충하십시오. 매체의 색이 노란색으로 변하면 매체 변경 빈도를 높입니다. 세포가 최대 7일 동안 증식하도록 하고 우물 중 하나라도 자라기 시작하면 실험을 중단합니다. 우물은 합류가 80 %를 초과 할 때 자란 것으로 간주됩니다. 배지를 흡인하고, 1x PBS로 세척하고, 0.25% 트립신(6웰 접시의 경우 500μL)으로 웰 바닥을 덮습니다. 세포가 접시에서 들어 올려질 때까지 5분 정도 기다립니다. 이것을 현미경으로 확인하십시오. 10% FBS를 함유한 완전한 DMEM 1mL로 트립신을 켄칭합니다. 세포 덩어리를 분해하기 위해 위아래로 피펫을 사용합니다. Coulter 카운터 컵에 각각 10mL의 이소톤 완충액(웰당 한 컵)을 채워 준비합니다. 셀 카운터의 셀 수를 세고 데이터를 기록합니다. 판독값이 밀리리터당 세포 수(cells/mL)인 경우 기록된 값에 1.5를 곱하여 웰당 총 세포 수를 구합니다.참고: 실험실에 Coulter 계수기가 없는 경우 혈구계와 같은 다른 세포 계수 방법으로 충분합니다. 2. DHODH 활성을 측정하기 위한 13C4-아스파르테이트 안정 동위원소 추적 및 LC-MS 분석 13부착 세포에서C4-아스파르테이트 안정 동위원소 추적참고: DHODH 활성은 13C4-아스파르테이트를 13C3-UMP에 혼입하는 것을 측정하여 직접 모니터링할 수 있습니다. Brequinar는 DHODH 활성에 대한 대조군으로 사용됩니다(그림 3). 13C3-UMP의 결과 수준은 DHODH 활성의 척도이다.250,000에서 500,000 사이의 세포를 6 웰 접시에 시드하여 다음날 75 % 합류를 달성합니다. 250 mM 13C 4-아스파르테이트 및 10 mM 13C4-아스파르테이트 배지의 원액을 준비하였다(표 1 참조). 각 웰의 배지를 10 mM 13C4-아스파르테이트를 함유하는 배지로 변경한다. 관심 있는 세포를 표지하기 위한 정상 상태를 달성하기 위해 적절한 시간 동안 배양합니다.참고: 정상 상태는 백분율로 표시된 대사 산물이 시간14에 따라 정체되는 시간 프레임으로 정의됩니다. 143B 골육종 세포의 경우, 13C4-아스파르테이트는 8시간까지 정상 상태를 달성합니다. 관심 있는 안정 동위원소로 시간 경과 실험을 수행하여 실험 전에 이 시간 프레임을 결정하는 것이 가장 좋습니다. 부착 세포로부터 대사 산물 분리시작하기 전에 드라이 아이스 통을 준비하고 HPLC 등급 물에 80 % HPLC 등급 MeOH를 준비하십시오. 이 버퍼를 -80°C 냉동고에서 밤새 식히거나 드라이아이스에 직접 올려 놓으십시오. 인큐베이터에서 한 번에 한 접시씩 꺼내 웰에서 배지를 흡인하고 1x PBS로 2배 세척합니다. 다음 단계로 이동하기 전에 웰에서 잔류 PBS를 모두 제거합니다.알림: 흡인 중에 플레이트를 기울이고 부착 세포의 파괴를 방지하기 위해 접시 벽에 피펫을 대십시오. 플레이트를 드라이 아이스에 놓고 즉시 20 % LCMS 등급 물에 800 μL의 80 % LCMS 등급 MeOH를 각 웰에 첨가하십시오. 세포 용해를 촉진하기 위해 플레이트를 -80°C 냉동고에서 최소 15분 동안 인큐베이션합니다.알림: 이 시점에서 다음 플레이트를 인큐베이터에서 꺼내고 2.2.1-2.2.4 단계를 반복할 수 있습니다. 모든 플레이트가 -80°C 냉동고에서 배양될 때까지 이것을 계속합니다. 냉동실에서 한 번에 한 접시씩 꺼내 셀 리프터를 사용하여 드라이아이스에서 각 웰을 긁어내고 용해물을 1.5mL 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 다음 단계까지 튜브를 드라이 아이스에 보관하십시오. 모든 튜브를 4°C에서 10분 동안 와동시킨 다음, 4°C에서 최대 속도(최소 17,000× g)로 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 1.5mL 미세원심분리기 튜브로 옮기고 -105°C 콜드 트랩이 장착된 4°C 진공 농축기에서 약 6시간 동안 또는 샘플이 증발할 때까지 고진공 설정에서 건조시킵니다. 용해물이 건조되면 대사 산물 펠릿을 -80 °C에서 질량 분석법(LCMS)과 쌍을 이루는 액체 크로마토그래피를 위해 준비할 준비가 될 때까지 보관합니다. 극성 대사산물의 액체 크로마토그래피-질량분석법(LC-MS) 측정참고: 새로운 피리 미딘 생합성의 중간체인 아스파르테이트를 검출할 수 있는 모든 크로마토그래피 및 질량분석법 워크플로우 및 UMP로 충분합니다14.건조된 펠릿에 100μL의 HPLC 등급 물을 첨가하고 4°C에서 10분 동안 볼텍스하여 얼음 위에서 LCMS용 샘플을 준비합니다. 샘플을 4°C에서 최대 속도(최소 17,000 × g)로 10분 동안 원심분리하고 25μL를 각 LC-MS 바이알에 넣습니다. 2μL의 용해물을 LC-MS 시스템에 주입합니다. 일반적으로 사용되는 방법론은 다음과 같습니다.LC-MS 등급의 물에 용해된 20mM 탄산암모늄(LC-MS 등급) 및 0.1% 수산화암모늄(LC-MS 등급)을 포함하는 이동상 A 를 준비합니다. 100% 아세토니트릴(LC-MS 등급)을 이동상 B로 선택합니다. 크로마토그래피의 경우 친수성 화합물에 대한 2.1mm x 20mm 가드 컬럼이 장착된 5μm, 150mm x 2.1mm 분석 컬럼을 선택합니다( 재료 표 참조). 컬럼 오븐을 25°C로 설정합니다. 다음 액체 크로마토그래피 설정을 사용하십시오: 0.15mL/min의 일정한 유속; 20분 동안 80%에서 20% 이동상 B로 선형 기울기, 0.5분 동안 20%에서 80% 이동상 B로 선형 기울기, 80% 이동상 B에서 7.5분 동안 유지. 다음 질량 분석기 설정을 선택합니다: m/z 70Da와 1,000Da 사이의 전체 스캔; 70,000의 해상도; 1 × 106의 AGC 목표; 최대 주입 시간은 20ms입니다. 극성 전환 모드에서 소스를 작동하십시오. 스프레이 전압을 3.0kV로, 가열된 모세관을 275°C로, HESI 프로브를 350°C로, 시스 가스 유량을 40단위로, 보조 가스 유량을 15단위로 설정하고, 스윕 가스 유량을 1단위로 설정합니다. LCMS 워크플로우와 인터페이스하는 모든 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석을 수행합니다.참고: 위의 워크플로에 사용되는 소프트웨어는 XCalibur(Thermo) 및 TraceFinder(Thermo)입니다. 데이터 분석에 대한 주요 고려 사항은 다음과 같습니다.예상 보존 시간: 실험 전에 크로마토그래피 방법을 사용하여 관심 있는 각 대사 산물에 대한 표준물질을 실행하여 각 대사 산물의 머무름 시간을 결정합니다.참고: UMP와 13C3-UMP를 포함한 동위원소의 머무름 시간은 정확히 동일합니다. 대사 산물에 대한 예상 M/Z: 대사 산물이 음이온 모드(예: UMP)에서 이온화되면 UMP에서 양성자를 뺀 분자식을 사용하여 예상되는 정확한 질량을 계산합니다[C9H14N2O9P]. 양이온 모드에서 이온화하는 대사 산물의 경우 분자식과 양성자를 사용하여 정확한 질량을 계산합니다. 질량 정확도: orbitrap 질량분석기를 사용할 때 관심 대사산물과 동위원소는 질량 정확도가 ±5mmu일 것으로 예상됩니다. 소프트웨어를 사용하여 예상 M/Z와 실제 감지된 M/Z를 고려하여 이를 계산합니다. 자연 풍부도 보정 : 모든 추적 데이터는 자연에서 ~1% 13C및 ~0.5% 15 N-동위원소를 설명하기 위해 자연 풍부도 보정을 거칠 것으로 예상됩니다 15. 3. SDH활성을 측정하기 위한 13 C5-글루타민 안정 동위원소 추적 13부착 세포에서C5-글루타민 안정 동위원소 추적참고: SDH 활성은 13C5-글루타민 추적 7,16,17에서 푸마레이트와 숙신산염의 특정 동위원소의 상호 전환을 측정하여 직접 모니터링할 수 있습니다. 복합체 III 억제제 안티마이신은 SDH 복합체의 순 방향성을 변경하기 위한 대조군으로 사용됩니다(그림 4).250,000에서 500,000 사이의 세포를 6 웰 접시에 시드하여 다음날 75 % 합류를 달성합니다. 50 mM 13C5-글루타민의 스톡을 준비하였다(표 1 참조). 2 mM 13C5-글루타민을 함유하는 추적 배지를 준비한다(표 1 참조). 각 웰의 배지를 2 mM 13C5-글루타민을 함유하는 배지로 변경한다. 관심 있는 세포를 라벨링하는 안정된 상태를 달성하기 위해 적절한 시간 동안 배양합니다(2.1.3단계의 참고 참조). 단계 2.2의 프로토콜에 따라 대사 산물을 분리합니다. 2.3단계에서 설명한 워크플로우에 따라 LC-MS에서 샘플을 분석합니다. 라벨링 패턴을 기반으로 SDH 활동 분석참고: SDH 복합체의 숙시네이트 산화 활성은 13C 5-글루타민 추적시 13C4-푸마르산염 대 13C 4-석시네이트의 비율을 평가하여 모니터링할 수 있습니다. SDH 복합체의 푸마레이트 환원 활성은 13C5-글루타민 추적시 13C3-석시네이트 대 13C3-푸마레이트의 비율을 평가함으로써 모니터링할 수 있다.13C3-푸마레이트, 13C4-푸마레이트, 13C3-숙시네이트 및 13C 4-숙시네이트의 백분율 표지를 계산합니다. 예를 들어, 13C3-푸마레이트의 백분율을 결정하기 위해, 푸마레이트 동위원소에 대한 모든 통합 피크 면적(표지되지 않은 푸마레이트, 13C1-푸마레이트, 13C2-푸마레이트, 13C3-푸마레이트, 및 13C4-푸마레이트)을 합산하고, 13C3-푸마레이트에 대한 피크 면적을 총 동위원소 면적으로 나눕니다. 100을 곱합니다. 숙시네이트 산화를 계산하기 위해, 백분율 13 C 4-푸마레이트를 백분율 13C4-숙시네이트로 나눕니다. 푸마레이트 환원을 계산하기 위해, 백분율 13 C 3-숙시네이트를 백분율 13C3-푸마레이트로 나눕니다. 4. 직접 복합체 I 활성 분석 참고 : DCPIP는 인공 전자 수용체입니다. 유비퀴놀에서 전자를 받아들일 때 환원된 형태로 바뀝니다. 이 분석에서 유비퀴논은 NADH의 NAD+로의 복합체 I 매개 산화를 통해 유비퀴놀로 환원됩니다. 따라서, 이러한 무세포 분석에서 산화된 DCPIP의 회전율을 측정하는 것은 복합체 I 활성에 대한 프록시이다 7,18. 세포에서 미토콘드리아를 정제하고 정량화하는 방법참고: 모든 미토콘드리아 정제 프로토콜이 이 분석에 활용될 수 있습니다19.25-1억 개의 세포가 얻어질 때까지 세포를 확장합니다. 접시에서 배지를 흡인하고, 1x PBS로 세척하고, PBS를 흡인하고, 0.25% 트립신으로 세포를 시험해 봅니다. 트립신을 배양 배지로 켄칭하고 세포를 1,000 × g 에서 5 분 동안 펠렛화합니다. 세포 펠릿을 1x PBS 5mL로 2x 세척하고 1,000× g 에서 5분 동안 원심분리를 반복하여 세포를 펠렛화합니다. 세척된 펠릿을 미토콘드리아 정제가 될 때까지 -20°C 냉동고에 보관합니다.알림: 세포 펠릿을 두 번 이상 동결-해동하지 마십시오. 미토콘드리아 분리 완충액을 준비합니다( 표 1 참조).참고: NaOH와 같은 나트륨 함유 시약은 나트륨이 미토콘드리아 막 전위(20 )를 손상시키고 미토콘드리아 칼슘 항상성(21)을 방해하기 때문에 미토콘드리아 분리 완충액을 준비하는 데 사용해서는 안 됩니다. 세포 펠릿을 미토콘드리아 분리 완충액 1mL당 1,000만 개의 세포로 재현탁합니다. 예를 들어, 10mL의 미토콘드리아 분리 완충액에 1억 개의 펠렛 세포를 재현탁합니다.알림: 버퍼에 기포가 유입되지 않도록 세포 덩어리를 방해해야 합니다. 2mL의 세포 현탁액을 Potter-Elvehjem PTFE 유봉과 호환되는 작업 부피 3-8mL의 사전 냉각 유리 균질화기로 옮깁니다. 세포를 10-20회 스트로크로 균질화하고 현미경으로 세포를 모니터링하여 균질화 과정 전반에 걸쳐 세포 용해를 확인합니다. 효율적인 세포 용해를 보장하기 위해 필요한 경우 스트로크 수를 늘립니다.참고: 위의 방법으로 세포를 균질화하는 것이 세포 용해에 효과적이지 않은 경우 주사기 용해 방법22로 전환하십시오. 세포 용해물 2mL를 얼음 위의 미세 원심분리 튜브로 옮기고 전체 세포 현탁액이 균질화될 때까지 위의 단계를 반복합니다. 핵 및 세포 파편을 4°C 원심분리기에서 10분 동안 650 × g 에서 펠렛화한다. 상층액을 새로운 2.0 mL 튜브로 옮기고, 4°C에서 10분 동안 650 × g 에서 위의 원심분리를 반복한다. 상청액을 새로운 2.0 mL 튜브로 옮기고, 4°C 원심분리기에서 10분 동안 7,000 × g 의 미토콘드리아를 펠렛화한다. 상층액을 버리고 펠릿을 1mL의 미토콘드리아 분리 완충액에 재현탁합니다. 단백질 정량을 위해 50 μL를 새 튜브로 옮깁니다. 샘플의 두 부분 표본(50 μL 샘플 및 나머지 ~950 μL)에 대해 위의 원심분리 단계를 반복합니다. 상층액을 버리고 펠릿을 사용할 준비가 될 때까지 -80 °C 냉동고에 보관하십시오. 50μL 분취액의 펠릿에 200μL의 RIPA 버퍼를 추가하여 단백질을 추출하고 10분 동안 소용돌이치고 21,000× g 에서 원심분리하여 단백질을 분리합니다. 50 μL 분취액의 단백질 양을 정량화하고 이 수치를 사용하여 950 μL 샘플의 나머지 단백질을 정량합니다. 예를 들어, 50 μL 분취량에 대한 단백질 정량이 1 μg/μL인 경우, 나머지 미토콘드리아 펠릿의 총 단백질은 950 μg(1 μg/μL × 950 μL)입니다. 복합체 I 활성 분석 수행참고: 143B 골육종 세포주가 이 분석에 활용되었지만 프로토콜은 모든 배양된 세포에 적용할 수 있습니다.정제된 미토콘드리아를 미토콘드리아 재현탁 완충액( 표 1 참조)에 5mg 단백질/mL의 최종 농도로 재현탁합니다. 미토콘드리아를 투과시키기 위해 -20°C 냉동고에서 5번의 동결/해동 주기를 수행합니다. 복합체 I 활성 분석 완충액을 확인한다( 표 1 참조). 5mg/mL 미토콘드리아 스톡 50ug을 복합체 I 활성 완충액 90μL와 혼합합니다. 복합 I 활성을 제어하기 위해 5개의 처리되지 않은 복제물과 5개의 로테논 처리된(5μM) 복제물을 준비합니다. 37°C로 설정된 플레이트 리더에서 600nm에서의 기준선 흡광도를 읽습니다. NADH를 2mM의 최종 농도로 첨가하여 반응을 시작하고, 1시간 동안 흡광도(600nm)를 추적하여 최소 2분마다 측정합니다. 흡광도의 감소는 복합체 I 활성을 통한 DCPIP의 감소를 나타낸다.참고: NADH는 모든 샘플이 동시에 시작되도록 하기 위해 멀티채널 피펫을 사용하여 추가해야 합니다. 5. 과산화물 수준을 측정하기 위한 LC-MS 기반 분석 참고: MitoSox Red의 형광 특성은 슈퍼옥사이드23과의 반응과 무관하게 변할 수 있습니다. 이 LC-MS 기반 분석은 MitoSox Red와 반응하는 과산화물의 생성물을 직접 측정합니다. 다음 분석은 Xiao et al.24에서 약간 수정되었습니다. 2-하이드록시미토에티듐(2-OH MitoE2+)은 슈퍼옥사이드 반응의 산물입니다(그림 5). 이 분석에는 Caki1 세포주가 사용되었지만 프로토콜은 모든 배양된 세포에 적용할 수 있습니다. 부착 세포를 MitoSox Red로 치료250,000에서 500,000 사이의 세포를 6 웰 접시에 시드하여 다음날 75 % 합류를 달성합니다. LC-MS 분석을 위한 플레이트 세트와 세포 수 정규화를 위한 플레이트 중복 세트를 시드해야 합니다. Dulbecco의 변형된 Eagle 배지에서 10% 열 비활성화 FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신을 포함하는 완전한 DMEM을 준비합니다. 모든 조건에 대해 모든 웰에서 배지를 2mL의 완전한 DMEM으로 새로 고칩니다. 이 시점에서 관심 있는 약물이나 치료법을 추가해야 합니다. 조직 배양 인큐베이터에서 세포를 1시간 동안 인큐베이션합니다. 양성 및 음성 대조군을 준비하십시오. PBS에 희석된 50mM tert-부틸 하이드로퍼옥사이드 스톡과 DMSO에 희석된 N-아세틸 시스테인(NAC)의 250mM 스톡을 준비합니다( 표 1 참조).참고: 테르트부틸 하이드로퍼옥사이드(tBuOOH)는 양성 대조군으로 작용하고 2-OH MitoE2+의 양을 증가시키는 강력한 활성 산소 종입니다. NAC는 음성 대조군 역할을 하고 tBuOOH로 인한 과산화물 생성을 중화하는 강력한 항산화제입니다. 양성 대조군 웰에 tBuOOH 1μL를 추가하고 음성 대조군 웰에 tBuOOH 1μL + NAC 100μL를 추가합니다.참고: P2 피펫(0.1-2 μL 범위)을 사용하는 것이 1 μL를 이송하는 최적의 방법입니다. 조직 배양 인큐베이터에서 1시간 동안 배양합니다. 1 mM MitoSox Red 스톡 (표 1 참조)을 준비하고, 1 μM의 최종 농도를 달성하기 위해 각 웰에 1 mM MitoSox Red 2 μL를 첨가한다. 이 최종 배양 동안, 최종 LC-MS 데이터를 정규화하기 위해 세포 계수를 획득하기 위해 중복 플레이트 중 하나를 계수합니다. 부착 세포에서 산화된 Mitosox Red 제품의 분리드라이아이스 한 통을 가져와서 분리를 시작하기 전에 드라이아이스에 차가운 HPLC 등급 이소프로판올을 놓습니다. 한 번에 하나의 플레이트를 꺼내 웰에서 배지를 흡인하고 1x PBS 1mL로 2x 세척합니다. 다음 단계로 이동하기 전에 웰에서 모든 잔류 PBS를 흡인합니다.알림: 흡인 중에 플레이트를 기울이고 부착 세포의 파손을 방지하기 위해 접시 벽에 피펫을 대십시오. 플레이트를 드라이 아이스에 놓고 800 μL의 HPLC 등급 이소프로판올을 각 웰에 첨가합니다. 세포 용해를 촉진하기 위해 플레이트를 -80°C 냉동고에서 최소 15분 동안 인큐베이션합니다.알림: 이 시점에서 다음 플레이트를 인큐베이터에서 꺼내 5.2.1-5.2.4 단계를 반복할 수 있습니다. 모든 플레이트가 -80°C 냉동고에서 배양될 때까지 이것을 계속합니다. 냉동실에서 한 번에 한 접시씩 꺼내 셀 리프터를 사용하여 드라이아이스에서 각 웰을 긁어내고 용해물을 1.5mL 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 다음 단계까지 튜브를 드라이 아이스에 보관하십시오. 모든 튜브를 4°C에서 10분 동안 와동시킨 다음, 4°C에서 최대 속도(최소 17,000× g)로 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 1.5mL 미세원심분리기 튜브로 옮기고 진공 농축기에서 건조시킵니다. 용해물이 건조되면 LC-MS가 준비될 때까지 대사산물 펠릿을 -80°C에서 보관합니다. MitoSox Red 및 2-하이드록시미토에티듐(2-OH MitoE2+)의 LC-MS 측정HPLC 등급 MeOH:클로로포름:물의 3:3:1 혼합물 100μL를 추가하여 얼음 위에서 LCMS용 샘플을 준비합니다. 4°C에서 10분 동안 소용돌이칩니다. 25 μL를 각 LC-MS 바이알에 옮깁니다. 나머지 샘플을 -80°C 냉동고에 보관합니다. 다음 액체 크로마토그래피 완충액을 제조한다: i) 완충액 A: 0.1% 포름산을 함유한 HPLC 등급 물; ii) 완충액 B: 0.1% 포름산을 함유한 HPLC 등급 아세토니트릴. Thermo XCalibur Instrument Setup 앱을 열어 분석법 개발을 시작합니다. 이 창의 왼쪽 사이드바에 있는 두 개의 상자를 찾습니다 – 첫 번째 상자는 크로마토그래피 분석법 개발을 허용하고 두 번째 상자는 질량 분석법 개발을 허용합니다. 액체 크로마토그래피 분석법 개발:유속을 0.25mL/분으로 설정하고 방법을 20% B에서 시작하여 12분 동안 95% B까지 상승시킵니다. 다음 1분 동안 버퍼 B를 다시 20% B로 떨어뜨리고 다음 2분 동안 이 수준을 유지합니다.참고: 20% B에서 마지막 2분 동안 흐르는 것은 컬럼 압력이 초기 압력으로 다시 떨어지고 적절한 버퍼 비율로 컬럼을 평형화하는 데 중요합니다. 이 평형화 단계를 포함하지 않으면 이후에 실행되는 모든 샘플에 대해 머무름 시간이 변경됩니다. 다음 매개 변수를 사용하여 Tune 파일을 만듭니다.Tune 앱을 열고 새 tune 파일을 만듭니다. 메서드 설정 모듈(5.3.9.3단계 참조)에서 겹치는 설정을 이 조정 파일에 적용합니다(스캔 범위, 해상도, 극성, AGC 대상 및 최대 IT 포함). Sheath 가스를 30으로, Aux 가스를 3으로, Sweep 가스도 3으로 설정합니다. 스프레이 전압을 3kV로, 모세관 온도를 300으로, S-렌즈 RF 레벨을 60으로 설정합니다. 질량분석법 개발:잠재적 스캔의 왼쪽 하단 목록에서 Full MS 를 창 중앙으로 끌어다 놓습니다. 드롭 후 전체 MS 사각형 을 클릭하여 설정을 조정해야 합니다. 총 MS 분석법 지속 시간은 13분입니다.참고: LC 분석법은 최종 2분이 대사산물 정량이 아닌 컬럼 재조정을 위한 것이기 때문에 MS 분석법보다 깁니다. 모듈 오른쪽의 메서드 속성에서 메서드 기간 및 실행 시간이 13.00분으로 설정되어 있는지 확인합니다. 이 전체 스캔을 해상도 70,000 및 AGC 대상 1 × 106에서 양수 모드로 실행합니다. 최대 IT를 100ms로 설정하고 스캔 범위를 300m/z에서 700m/z로 설정합니다. 모듈 위쪽의 파일 튜닝에서 방금 만든 튜닝 파일이 이 메서드에 연결되어 있는지 확인합니다. 2 μL 시료 주입으로 MitoSox Red 검출 분석법을 실행합니다.