ここでは、分子状酸素を消費する能力とは無関係に、哺乳類細胞のミトコンドリア機能を直接測定するためのアッセイをまとめたものです。
ミトコンドリア電子伝達系(ETC)における電子の流れは、哺乳類細胞における多面的な生合成、生体エネルギー、およびシグナル伝達機能をサポートしています。酸素(O2)は哺乳類ETCにとって最も遍在する末端電子受容体であるため、O2 消費速度はミトコンドリア機能の代理として頻繁に使用される。しかし、新たな研究は、フマル酸塩が低酸素状態でミトコンドリア機能を維持するための代替電子受容体として使用できるため、このパラメーターが必ずしもミトコンドリア機能を示すとは限らないことを示しています。この記事では、研究者がO2 消費速度とは無関係にミトコンドリア機能を測定できるようにする一連のプロトコルをまとめています。これらのアッセイは、低酸素環境におけるミトコンドリア機能を研究する場合に特に有用である。具体的には、ミトコンドリアATP産生、 de novo ピリミジン生合成、複合体IによるNADH酸化、およびスーパーオキシド産生を測定する方法について説明します。従来の呼吸測定実験と組み合わせることで、これらの直交的で経済的なアッセイは、研究者に関心のあるシステムにおけるミトコンドリア機能のより包括的な評価を提供します。
ミトコンドリア機能は、哺乳類細胞の主要な生合成、生体エネルギー、およびシグナル伝達機能を維持するため、細胞の健康の重要な指標です1。ミトコンドリア機能の大部分は電子伝達系(ETC)を通る電子の流れを必要とし、ETCにおける電子の流れの中断は重篤なミトコンドリア病を引き起こします2。ETCは、ミトコンドリア内膜に埋め込まれた一連の還元・酸化(酸化還元)反応で構成されており、これらの電子移動反応は自由エネルギーを放出し、ATP合成、熱発生などの生理過程、de novoピリミジン生合成などの生合成経路、NADHなどの補因子の酸化還元状態のバランスをサポートします。ETC複合体IおよびIIIは活性酸素種(ROS)3,4,5を生成し、HIF、PI3K、NRF2、NFκB、MAPK 6などのシグナル伝達主要経路を調節します。その結果、ETCにおける電子の流れの測定基準は、哺乳類細胞におけるミトコンドリア機能の代理として古典的に使用されている。
呼吸測定実験は、哺乳類細胞のミトコンドリア機能を測定するために頻繁に使用されます。O2は哺乳類ETCにとって最も遍在する末端電子受容体であるため、その還元はミトコンドリア機能の代理として使用されます。しかし、新たな証拠は、哺乳類のミトコンドリアが、de novoピリミジン生合成7、NADH酸化7、硫化水素の解毒8など、ETCに依存するミトコンドリア機能を維持するための電子受容体としてフマル酸塩を使用できることを示しています。したがって、特定の状況、特に低酸素環境において、O2消費速度(OCR)の測定は、ミトコンドリア機能の正確または正確な指標を提供しない。
ここでは、OCRとは無関係にミトコンドリア機能を測定するために使用できる一連のアッセイの概要を説明します。複合体Iを介したNADH酸化、ジヒドロオロチン酸デヒドロゲナーゼを介した de novo ピリミジン生合成、複合体V依存性ATP合成、コハク酸デヒドロゲナーゼ(SDH)複合体の正味の方向性、およびミトコンドリア由来ROSを直接測定するアッセイを提供しています。これらのアッセイは、培養哺乳類細胞に対して実施することを意図しているが、その多くは in vivoでの ミトコンドリア機能の研究に適応させることができる。特に、このプロトコルに記載されているアッセイは、OCRよりもミトコンドリア機能のより直接的な測定です。さらに、それらは、OCRが指標測定ではない状況である低酸素状態でのミトコンドリア機能の測定を可能にします。まとめると、これらのアッセイは、古典的な呼吸測定実験と組み合わせて、哺乳類細胞のミトコンドリア機能のより包括的な評価を研究者に提供します。
新たな研究により、哺乳類のミトコンドリアは分子状酸素を消費せずに機能できることが示されているため、研究者がミトコンドリアの機能を正確に定量化するために、OCR測定を超えて直交アッセイを採用することが最も重要です。ここでは、ミトコンドリアNAD+/NADHバランス、適応末端電子受容体の利用、ATPの産生、 de novo ピリミジン生合成、およびミトコンドリア由来ROSを測定することにより、複合体I、複合体II、複合体V、およびDHODHの活性を直接評価するために使用できる一連のアッセイをまとめました。特に、これらのアッセイは、OCR測定よりもミトコンドリア機能をより直接的に測定します。さらに、これらのアッセイは、低酸素状態のミトコンドリア機能を定量化するための扱いやすい方法を研究者に提供しますが、フマル酸塩が好まれる末端電子受容体として使用されているため、OCR測定はほとんど無関係です。最後に、ここで説明する増殖ベースの方法は、従来の呼吸測定実験よりも費用効果が高いため、哺乳類システムのミトコンドリア機能を研究するための広くアクセス可能な方法を提供します。
これらのアッセイを利用して培養細胞のミトコンドリア機能を測定する際には、重要な考慮事項があります。増殖アッセイに関しては、各細胞株の倍増率に合わせて播種する細胞数を調整することが重要です。細胞は、増殖の違いを定量化できるように、少なくとも10%のコンフルエントに播種し、3〜4倍に十分なスペースを確保する必要があります。各アッセイの別の考慮事項は、各ETC複合体の活性のコントロールとして使用される低分子の濃度です。異なる細胞株はこれらの阻害剤に対して異なる感受性を示す可能性があるため、これらの低分子の用量をテストして最適な濃度を特定することが重要です。
OCR測定およびここに記載されているすべてのアッセイを含む、in vitroでミトコンドリア機能を研究するアッセイの普遍的な制限は、培地の代謝組成です。標準的な細胞培養培地は、システムを表面的に高いレベルのミトコンドリア機能に偏らせる傾向があります。例えば、超生理学的グルタミンレベルは、TCAサイクル25のアナプレローシスを増加させ、ミトコンドリアNADH合成を促進し、その結果、酸化的リン酸化を増加させる。同様に、酸素分圧は、哺乳類組織では3mmHgから100mmHg(約0.1%〜13%O2)の範囲であるが、インビトロでは大気(140mmHg、約21%)である26,27。この過剰のO2は、ミトコンドリア呼吸能力およびスーパーオキシド産生を最大にする28。最近、より生理学的になるように培養培地を設計する努力がなされている29、30。注目すべきことに、ヒト血漿様培地中で細胞を培養すると、一部の癌細胞株30におけるミトコンドリア呼吸、T細胞31におけるミトコンドリアROS、および癌治療へのミトコンドリア適応32が減少する。したがって、使用する培地の組成に注意し、それがミトコンドリア機能にどのように影響するかを理解することが重要です。
ミトコンドリア機能の解釈における別の重要かつ普遍的な制限は、ミトコンドリアの数の違いの可能性である。したがって、mtDNA33の定量、膜電位非感受性色素34によるミトコンドリア質量の測定、またはミトコンドリアマーカーのウェスタンブロッティングのいずれかを通じてミトコンドリア含有量を測定することが重要です。これは、ミトコンドリア数の減少がミトコンドリア機能の低下と間違えられないようにするための重要な制御です。
また、ここで説明するアッセイに適用される特定の制限とトラブルシューティングもあります。第一に、分化した細胞が増殖しないことを考えると、増殖ベースのアッセイは、この文脈でミトコンドリア機能を評価するのに有用ではないであろう。DHODH活性を測定するための13C4-アスパラギン酸トレースプロトコルの主な制限は、細胞内でのアスパラギン酸の取り込みが非常に非効率的である可能性があることです35。この潜在的な限界を克服するために、研究者はアスパラギン酸トランスポーターSLC1A3を過剰発現して、13C4-アスパラギン酸の取り込みを促進することができます35。
SDH活性を測定するために13C5-グルタミントレースを使用するプロトコルの制限は、このアッセイでは、逆活性を測定するために細胞が還元カルボキシル化経路を利用してM+3同位体を濃縮する必要があることです。一部の細胞株は、ATPクエン酸リアーゼ発現が低い36、不十分なHIF安定化37、またはα-KG:クエン酸比が低すぎる38のために、還元的カルボキシル化フラックスができません。この制限を克服するために、13C4-アスパラギン酸トレースを利用してSDHの順方向および逆方向の活動を測定することができます7。このアッセイでは、SDHの前方活性は、フマル酸塩M+2:コハク酸塩M+2の比と、コハク酸M+4:フマル酸塩M+4の逆反応によって測定できます。特に、このトレースは還元的カルボキシル化経路のほとんどの酵素を回避します。
読み出しとしてDCPIP還元を使用する複合体I活性アッセイの制限は、ミトコンドリアが構造的に無傷ではないことである。ミトコンドリアを凍結融解してアッセイのためのNADH取り込みを可能にするプロセスは、ミトコンドリア膜の構造的完全性を確実に損なう可能性がある39。このアッセイは、複合体I増殖アッセイなどのアッセイと並行して実施し、観察された複合体I活性の変化が無傷の細胞にも当てはまることを確認する必要があります。
将来の研究では、これらの技術のいくつかは、マウスやCaenorhabditis elegansなどのモデル生物を使用して、in vivoでミトコンドリア機能を測定するために適用することができます。生体内でミトコンドリア機能を測定するために使用されている現在の方法は、生物レベルのOCR、特にマウスモデルを使用した場合の呼吸交換速度に集中しています。この方法の明らかな制限は、酸素がミトコンドリアETCのユビキタス末端電子受容体としての役割を超えて、多くの生化学的およびシグナル伝達機能を果たすことです。例えば、酸素はジオキシゲナーゼファミリーの酵素の触媒活性によって「消費」される。これらの酵素は細胞の酸素消費速度に寄与しますが、ミトコンドリア機能に参加、調節、または反映しません。in vitroでの古典的な呼吸測定実験は、典型的には「非ミトコンドリアOCR」を制御するが、生物呼吸交換比(RER)実験はこれを制御できず、in vivoでのミトコンドリア機能の指標としてのRERの解釈を制限する。しかし、13C4-アスパラギン酸トレースによるDHODH活性、13C5-グルタミントレースによる複合体II活性、組織から精製したミトコンドリアに対する複合体I活性、およびMitoBなどのLC-MSに優しい化合物を用いたミトコンドリアROSを測定するためにプロトコルを適応させて、in vivoでのミトコンドリア機能を測定することは可能です.ミトコンドリアの機能を調べるためのこれらの直接アッセイは、古典的な呼吸測定実験と組み合わせて、研究者に哺乳類の細胞および組織におけるミトコンドリア機能のより包括的で正確な評価を提供します。
The authors have nothing to disclose.
この原稿で制作された図は、BioRender.com で作成されました。この記事に関するフィードバックを提供してくださった Amy Walker に感謝します。J.B.S.はウースター生物医学研究助成財団の支援を受けました。
1.5 mL tube | Cell Treat | 667443 | |
2.0 mL tube | Cell Treat | 229446 | |
6-well plate | Cell Treat | 229106 | |
12-well plate | Cell Treat | 229112 | |
13C4-aspartate | Sigma-Aldrich | 604852 | |
13C5-Glutamine | Cambridge Isotope Laboratories | 285978-14-5 | |
15 mL centrifuge tube | Cell Treat | 667411 | |
50 mL centrifuge tube | Cell Treat | 667421 | |
150 mm tissue culture dish | Cell Treat | 229651 | |
1x Phosphate-buffered saline | Gibco | 10010049 | |
2,6-dichlorophenolindophenol | Honeywell | 33125 | |
Ammonium Carbonate | Sigma-Aldrich | 37999 | |
Antimycin | Sigma-Aldrich | A8674 | |
Ascentis Express C18 | Sigma-Aldrich | 53825-U | |
Bottle top filter 500 mL, 0.22 µm, PES 9 9 mm membrane diameter | Cell Treat | 229717 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A3294 | |
Brequinar | Sigma-Aldrich | SML0113 | |
Cell Lifter, Double End Flat and Narrow Blade | Cell Treat | 229305 | |
CentriVap -105 Cold Trap | Labconco | 7385020 | |
Complete Protease Inhibitor Tablets | Sigma-Aldrich | 4693116001 | |
Coulter Counter Cups | Fisher Scientific | 07-000-694 | |
Decylubiquinone | Sigma-Aldrich | D7911 | |
DMSO | Invitrogen | D12345 | |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11995-065 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | |
EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
Eppendorf Centrifuge 5425R | Eppendorf | 2231000908 | |
Eppendorf Centrifuge 5910 Ri | Eppendorf | 5943000343 | |
Galactose | Sigma-Aldrich | G5388 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
Glucose-free DMEM | Gibco | 11966025 | |
Glutamine-free DMEM | Thermo Fisher | 11960044 | |
Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | |
HPLC-grade 35% Ammonium hydroxide | Thermo Scientific | 460801000 | |
HPLC-grade Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 900667 | |
HPLC-grade Chloroform | Sigma-Aldrich | 366927 | |
HPLC-grade formic acid | Thermo Scientific | 28905 | |
HPLC-grade Isopropanol | Sigma-Aldrich | 563935 | |
HPLC-grade MeOH | Sigma-Aldrich | 900688 | |
HPLC-grade Water | Sigma-Aldrich | 270733 | |
Human Osteosarcome Cell Line 143B | ATCC | CRL-8303 | |
Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | 320331-500ML | |
Isotone buffer | Beckman Coulter | 8546719 | |
K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P2222 | |
Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | |
MitoSox Red | Invitrogen | M36008 | |
N-acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
Oligomycin | Sigma-Aldrich | 75351-5MG | |
Pencillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Potter-Elvehjem Tissue Grinder, Size 21 | Kimble | 885502-0021 | |
Pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
Pyruvate-free DMEM media | Gibco | 11965175 | |
Q Exactive Plus Mass Spectrometer | Thermo Scientific | 726030 | |
ReCO2ver Incubator | Baker | ||
Refrigerated Centrivap Benchtop Vacuum Concentrator | Labconco | 7310020 | |
RIPA Buffer | Millipore Sigma | 20188 | |
Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
SeQuant ZIC-pHILIC 5μm 150 x 2.1 mm analytical column | Sigma-Aldrich | 1.50460.0001 | |
SeQuant ZIC-pHILIC guard kit | Millipore Sigma | 1.50438.0001 | |
Sodium Hydroxide, Pellets | Millipore Sigma | 567530-250GM | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
SW, TRACEFINDER 5.1 SP3 | Thermo Scientific | OPTON-31001 | |
Tert-butyl hydroperoxide solution | Sigma-Aldrich | 458139 | |
Tris | Sigma-Aldrich | 93352 | |
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25-200-114 | |
Uridine | Sigma-Aldrich | U3003 | |
VANQUISH HORIZON / FLEX HPLC | Thermo Scientific | VF-S01-A-02 | |
Z2 Coulter Particle count and size analyzer | Beckman Coulter | BZ10131270 |