Qui, presentiamo una raccolta di saggi per misurare direttamente la funzione mitocondriale nelle cellule di mammifero indipendentemente dalla loro capacità di consumare ossigeno molecolare.
Il flusso di elettroni nella catena di trasporto degli elettroni mitocondriali (ETC) supporta funzioni biosintetiche, bioenergetiche e di segnalazione multiformi nelle cellule di mammifero. Poiché l’ossigeno (O 2) è l’accettore di elettroni terminale più diffuso per l’ETC dei mammiferi, il tasso di consumo di O2 viene spesso utilizzato come proxy per la funzione mitocondriale. Tuttavia, la ricerca emergente dimostra che questo parametro non è sempre indicativo della funzione mitocondriale, poiché il fumarato può essere impiegato come accettore di elettroni alternativo per sostenere le funzioni mitocondriali nell’ipossia. Questo articolo compila una serie di protocolli che consentono ai ricercatori di misurare la funzione mitocondriale indipendentemente dal tasso di consumo di O2. Questi test sono particolarmente utili quando si studia la funzione mitocondriale in ambienti ipossici. In particolare, descriviamo metodi per misurare la produzione mitocondriale di ATP, la biosintesi de novo delle pirimidine, l’ossidazione del NADH da parte del complesso I e la produzione di superossido. In combinazione con i classici esperimenti di respirometria, questi saggi ortogonali ed economici forniranno ai ricercatori una valutazione più completa della funzione mitocondriale nel loro sistema di interesse.
La funzione mitocondriale è una metrica critica della salute cellulare, in quanto sostiene le principali funzioni biosintetiche, bioenergetiche e di segnalazione nelle cellule di mammifero1. La stragrande maggioranza delle funzioni mitocondriali richiede il flusso di elettroni attraverso la catena di trasporto degli elettroni (ETC) e le interruzioni del flusso di elettroni nell’ETC causano gravi malattie mitocondriali2. L’ETC è composto da una serie di reazioni di riduzione e ossidazione (redox) che sono incorporate nella membrana mitocondriale interna e queste reazioni di trasferimento di elettroni rilasciano energia libera che può essere sfruttata per supportare la sintesi di ATP, processi fisiologici come la termogenesi, vie biosintetiche come la biosintesi de novo delle pirimidine e l’equilibrio dello stato redox di co-fattori come il NADH. I complessi I e III di ETC producono specie reattive dell’ossigeno (ROS)3,4,5, che, a loro volta, regolano le vie chiave di segnalazione come HIF, PI3K, NRF2, NFκB e MAPK 6. Di conseguenza, le metriche del flusso di elettroni nell’ETC sono classicamente utilizzate come proxy per la funzione mitocondriale nelle cellule di mammifero.
Gli esperimenti di respirometria sono frequentemente impiegati per misurare la funzione mitocondriale nelle cellule di mammifero. Poiché O2 è l’accettore di elettroni terminale più diffuso per l’ETC dei mammiferi, la sua riduzione viene utilizzata come proxy per la funzione mitocondriale. Tuttavia, prove emergenti dimostrano che i mitocondri dei mammiferi possono impiegare il fumarato come accettore di elettroni per sostenere le funzioni mitocondriali che dipendono dall’ETC, tra cui la biosintesi de novo della pirimidina 7, l’ossidazione del NADH7 e la disintossicazione dell’idrogeno solforato8. Pertanto, in alcuni contesti, specialmente in ambienti ipossici, le misurazioni del tasso di consumo di O2 (OCR) non forniscono un’indicazione precisa o accurata della funzione mitocondriale.
Qui, delineiamo una serie di saggi che possono essere impiegati per misurare la funzione mitocondriale indipendentemente dall’OCR. Forniamo saggi per misurare direttamente l’ossidazione complessa del NADH I-mediata, la biosintesi de novo pirimidina mediata dalla diidroorotato deidrogenasi, la sintesi complessa di ATP V-dipendente, la direzionalità netta del complesso succinato deidrogenasi (SDH) e i ROS derivati dai mitocondri. Questi test sono pensati per essere eseguiti su cellule di mammifero in coltura, anche se molti possono essere adattati per studiare le funzioni mitocondriali in vivo. In particolare, i saggi descritti in questo protocollo sono misurazioni più dirette delle funzioni mitocondriali rispetto all’OCR. Inoltre, consentono la misurazione della funzione mitocondriale nell’ipossia, un contesto in cui l’OCR non è una misurazione indicativa. Nel loro insieme, questi test, in combinazione con i classici esperimenti di respirometria, forniranno ai ricercatori una valutazione più completa della funzione mitocondriale nelle cellule di mammifero.
Poiché la ricerca emergente dimostra che i mitocondri dei mammiferi possono funzionare senza consumare ossigeno molecolare, è della massima importanza per i ricercatori impiegare saggi ortogonali, oltre alle misurazioni OCR, per quantificare con precisione la funzione mitocondriale. Qui, abbiamo compilato una serie di saggi che possono essere utilizzati per valutare direttamente le attività del complesso I, complesso II, complesso V e DHODH misurando l’equilibrio mitocondriale NAD + / NADH, l’utilizzo di accettori di elettroni terminali adattivi, la produzione di ATP, la biosintesi de novo pirimidina e ROS derivato dai mitocondri. In particolare, questi test misurano più direttamente la funzione mitocondriale rispetto alle misurazioni OCR. Inoltre, questi saggi forniscono ai ricercatori modi trattabili per quantificare la funzione mitocondriale durante l’ipossia, per la quale le misurazioni OCR sono in gran parte irrilevanti a causa del fumarato utilizzato come accettore di elettroni terminale preferito. Infine, i metodi basati sulla proliferazione qui descritti sono più convenienti rispetto ai classici esperimenti di respirometria, fornendo così un modo ampiamente accessibile per studiare la funzione mitocondriale nei sistemi dei mammiferi.
Ci sono considerazioni chiave quando si utilizzano questi saggi per misurare la funzione mitocondriale nelle cellule in coltura. Per quanto riguarda i saggi di proliferazione, è importante regolare il numero di cellule seminate per il tasso di raddoppio di ciascuna linea cellulare. Le cellule dovrebbero essere seminate ad almeno il 10% di confluenza e con spazio sufficiente per consentire tre o quattro raddoppi in modo che le differenze di proliferazione possano essere quantificate. Un’altra considerazione per ogni test è la concentrazione delle piccole molecole utilizzate come controlli per le attività di ciascun complesso ETC. Poiché diverse linee cellulari possono mostrare sensibilità diverse a questi inibitori, è fondamentale testare la dose di queste piccole molecole per identificare la concentrazione ottimale.
Una limitazione universale dei saggi che studiano la funzione mitocondriale in vitro, comprese le misurazioni OCR e tutti i saggi qui descritti, è la composizione metabolica del terreno di coltura. Il terreno di coltura cellulare standard tende a polarizzare i sistemi in livelli superficialmente elevati di funzione mitocondriale. Ad esempio, i livelli soprafisiologici di glutammina aumentano la sua anaplerosi del ciclo TCA25, che alimenta la sintesi mitocondriale di NADH e, di conseguenza, aumenta la fosforilazione ossidativa. Allo stesso modo, la pressione parziale dell’ossigeno varia tra 3 mmHg e 100 mmHg (circa 0,1%-13% O2) nei tessuti dei mammiferi, ma è atmosferica (140 mmHg, circa il 21%) in vitro26,27. Questo eccesso di O2 massimizza la capacità respiratoria mitocondriale e la produzione di superossido28. Recentemente, sono stati fatti sforzi per progettare terreni di coltura per essere più fisiologici29,30. In particolare, la coltura di cellule in terreni simili al plasma umano diminuisce la respirazione mitocondriale in alcune linee cellulari tumorali30, i ROS mitocondriali nelle cellule T 31 e gli adattamenti mitocondriali alle terapie antitumorali32. Pertanto, è fondamentale essere consapevoli della composizione dei terreni di coltura utilizzati e capire come può influire sulla funzione mitocondriale.
Un’altra limitazione importante e universale nell’interpretazione della funzione mitocondriale è il potenziale di differenze nel numero di mitocondri. È quindi fondamentale misurare il contenuto mitocondriale attraverso la quantificazione del mtDNA33, la misurazione della massa mitocondriale con coloranti insensibili al potenziale di membrana34 o il western blotting dei marcatori mitocondriali. Questo è un controllo critico in modo che una diminuzione del numero di mitocondri non venga scambiata per una diminuzione della funzione mitocondriale.
Esistono anche limitazioni specifiche e risoluzione dei problemi che si applicano ai test descritti qui. In primo luogo, dato che le cellule differenziate non proliferano, i saggi basati sulla proliferazione non saranno utili per valutare la funzione mitocondriale in questo contesto. Una limitazione chiave del protocollo di tracciamento 13C 4-aspartato per misurare l’attività DHODH è che l’assorbimento di aspartato nelle cellule può essere estremamente inefficiente35. Per superare questa potenziale limitazione, i ricercatori possono sovraesprimere il trasportatore dell’aspartato, SLC1A3, per facilitare l’assorbimento di 13C 4-aspartato35.
Una limitazione del protocollo che utilizza il tracciamento di 13C 5-glutammina per misurare l’attività SDH è che questo test richiede alle cellule di utilizzare la via di carbossilazione riduttiva per arricchire gli isotopologhi M + 3 al fine di misurare l’attività inversa. Alcune linee cellulari sono incapaci di flusso di carbossilazione riduttivo a causa della bassa espressione di ATP citrato liasi36, insufficiente stabilizzazione HIF 37 o un rapporto α-KG:citrato troppo basso38. Per superare questa limitazione, si potrebbe utilizzare il tracciamento 13C 4-aspartato per misurare le attività SDH avanti e indietro7. In questo test, l’attività diretta dell’SDH può essere misurata dal rapporto tra il fumarato M+2:succinato M+2 e la reazione inversa del succinato M+4:fumarato M+4. In particolare, questo tracciamento aggira la maggior parte degli enzimi nella via di carbossilazione riduttiva.
Una limitazione del complesso test di attività I che utilizza la riduzione DCPIP come lettura è che i mitocondri non sono strutturalmente intatti. Il processo di congelamento-scongelamento dei mitocondri per consentire il loro assorbimento di NADH per il test può certamente offuscare l’integrità strutturale della membrana mitocondriale39. Questo test deve essere eseguito in parallelo con saggi come il saggio di proliferazione del complesso I per garantire che i cambiamenti nell’attività del complesso I osservati siano veri anche con cellule intatte.
In studi futuri, alcune di queste tecniche possono essere adattate per misurare le funzioni mitocondriali in vivo utilizzando organismi modello come topi e Caenorhabditis elegans. Gli attuali metodi utilizzati per misurare la funzione mitocondriale in vivo sono centrati sull’OCR a livello di organismo, で particolare sul tasso di scambio respiratorio quando si utilizzano modelli murini. Una chiara limitazione di questo metodo è che l’ossigeno svolge molte funzioni biochimiche e di segnalazione al di là del suo ruolo di onnipresente accettore di elettroni terminali nell’ETC mitocondriale. Ad esempio, l’ossigeno viene “consumato” dall’attività catalitica degli enzimi della famiglia delle diossigenasi. Sebbene questi enzimi contribuiscano al tasso di consumo di ossigeno cellulare, non partecipano, regolano o riflettono la funzione mitocondriale. Gli esperimenti di respirometria classica in vitro controllano tipicamente l'”OCR non mitocondriale”, mentre gli esperimenti sul rapporto di scambio respiratorio (RER) dell’organismo non possono controllare questo, limitando l’interpretazione della RER come metrica per la funzione mitocondriale in vivo. Tuttavia, è possibile adattare i protocolli per misurare l’attività del DHODH tramite il tracciamento di 13 C 4-aspartato, l’attività del complesso II tramite il tracciamento della 5-glutammina 13C, l’attività del complesso I sui mitocondri purificati dai tessuti e i ROS mitocondriali utilizzando composti compatibiliLC-MS come MitoB per misurare la funzione mitocondriale in vivo . Questi saggi diretti per interrogare le funzioni mitocondriali, in combinazione con i classici esperimenti di respirometria, forniscono ai ricercatori una valutazione più completa e accurata della funzione mitocondriale nelle cellule e nei tessuti dei mammiferi.
The authors have nothing to disclose.
Le figure prodotte in questo manoscritto sono state create con BioRender.com. Siamo grati ad Amy Walker per aver fornito feedback su questo articolo. J.B.S. è stato sostenuto dalla Worcester Foundation for Biomedical Research Grant.
1.5 mL tube | Cell Treat | 667443 | |
2.0 mL tube | Cell Treat | 229446 | |
6-well plate | Cell Treat | 229106 | |
12-well plate | Cell Treat | 229112 | |
13C4-aspartate | Sigma-Aldrich | 604852 | |
13C5-Glutamine | Cambridge Isotope Laboratories | 285978-14-5 | |
15 mL centrifuge tube | Cell Treat | 667411 | |
50 mL centrifuge tube | Cell Treat | 667421 | |
150 mm tissue culture dish | Cell Treat | 229651 | |
1x Phosphate-buffered saline | Gibco | 10010049 | |
2,6-dichlorophenolindophenol | Honeywell | 33125 | |
Ammonium Carbonate | Sigma-Aldrich | 37999 | |
Antimycin | Sigma-Aldrich | A8674 | |
Ascentis Express C18 | Sigma-Aldrich | 53825-U | |
Bottle top filter 500 mL, 0.22 µm, PES 9 9 mm membrane diameter | Cell Treat | 229717 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A3294 | |
Brequinar | Sigma-Aldrich | SML0113 | |
Cell Lifter, Double End Flat and Narrow Blade | Cell Treat | 229305 | |
CentriVap -105 Cold Trap | Labconco | 7385020 | |
Complete Protease Inhibitor Tablets | Sigma-Aldrich | 4693116001 | |
Coulter Counter Cups | Fisher Scientific | 07-000-694 | |
Decylubiquinone | Sigma-Aldrich | D7911 | |
DMSO | Invitrogen | D12345 | |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11995-065 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | |
EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
Eppendorf Centrifuge 5425R | Eppendorf | 2231000908 | |
Eppendorf Centrifuge 5910 Ri | Eppendorf | 5943000343 | |
Galactose | Sigma-Aldrich | G5388 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
Glucose-free DMEM | Gibco | 11966025 | |
Glutamine-free DMEM | Thermo Fisher | 11960044 | |
Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F4135 | |
Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | |
HPLC-grade 35% Ammonium hydroxide | Thermo Scientific | 460801000 | |
HPLC-grade Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 900667 | |
HPLC-grade Chloroform | Sigma-Aldrich | 366927 | |
HPLC-grade formic acid | Thermo Scientific | 28905 | |
HPLC-grade Isopropanol | Sigma-Aldrich | 563935 | |
HPLC-grade MeOH | Sigma-Aldrich | 900688 | |
HPLC-grade Water | Sigma-Aldrich | 270733 | |
Human Osteosarcome Cell Line 143B | ATCC | CRL-8303 | |
Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | 320331-500ML | |
Isotone buffer | Beckman Coulter | 8546719 | |
K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P2222 | |
Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | |
MitoSox Red | Invitrogen | M36008 | |
N-acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
Oligomycin | Sigma-Aldrich | 75351-5MG | |
Pencillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Potter-Elvehjem Tissue Grinder, Size 21 | Kimble | 885502-0021 | |
Pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
Pyruvate-free DMEM media | Gibco | 11965175 | |
Q Exactive Plus Mass Spectrometer | Thermo Scientific | 726030 | |
ReCO2ver Incubator | Baker | ||
Refrigerated Centrivap Benchtop Vacuum Concentrator | Labconco | 7310020 | |
RIPA Buffer | Millipore Sigma | 20188 | |
Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
SeQuant ZIC-pHILIC 5μm 150 x 2.1 mm analytical column | Sigma-Aldrich | 1.50460.0001 | |
SeQuant ZIC-pHILIC guard kit | Millipore Sigma | 1.50438.0001 | |
Sodium Hydroxide, Pellets | Millipore Sigma | 567530-250GM | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
SW, TRACEFINDER 5.1 SP3 | Thermo Scientific | OPTON-31001 | |
Tert-butyl hydroperoxide solution | Sigma-Aldrich | 458139 | |
Tris | Sigma-Aldrich | 93352 | |
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25-200-114 | |
Uridine | Sigma-Aldrich | U3003 | |
VANQUISH HORIZON / FLEX HPLC | Thermo Scientific | VF-S01-A-02 | |
Z2 Coulter Particle count and size analyzer | Beckman Coulter | BZ10131270 |