测量哺乳动物线粒体功能的氧非依赖性测定

1. 增殖测定以测量复合物I，二氢乳清酸脱氢酶（DHODH）和复合物V活性的活性 用于增殖测定的接种细胞注意：本协议使用从ATCC商业购买的人骨肉瘤细胞系143B。该细胞系是根据我们批准的机构生物安全委员会（IBC）协议的指南使用的。从组织培养箱中取出板。从平板中吸出培养基，并用 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 洗涤以去除任何剩余的培养基。吸出PBS，并用0.05%-0.25%胰蛋白酶覆盖培养皿以从板底部提起细胞。 等待3-5分钟，让胰蛋白酶从平板中释放细胞，然后用10mL含有10%胎牛血清（FBS）的所需生长培养基淬灭胰蛋白酶。 将细胞收集在锥形管中，并以1，000× g 离心5分钟以沉淀细胞。 从管中吸出培养基而不干扰沉淀。用完全培养基重悬沉淀。 计数细胞，并量化在 6 孔板中接种 10，000 至 25，000 个细胞所需的体积。注意：每个细胞系都需要针对要接种的细胞数量进行优化。达到的理想汇合度在实验开始时为~10%，在实验结束时为~80%。 将细胞移液到 6 孔板中，并向孔中加入 2 mL 完全培养基。静置24小时，然后切换到实验培养基条件。注意：每个条件至少播种三个重复和足够的孔来测试未处理的对照条件，抑制剂处理的对照条件，未处理的实验条件和抑制剂处理的实验条件。 培养基变化以评估增殖的复合V活性注意：在含有半乳糖的培养基中增殖的细胞依赖于ATP合成的复合V活性9，10。与糖酵解产生净两个ATP的葡萄糖不同，半乳糖不产生任何ATP，迫使细胞依赖于复合物V进行ATP合成（图1）。复合V抑制剂寡霉素用作对照。制作10mM含葡萄糖的培养基（见 表1）。 制作10 mM含半乳糖的培养基（见 表1）。 将每个孔中的培养基更换为含葡萄糖的DMEM或含半乳糖的DMEM。向相关孔中加入5μM寡霉素（复合V抑制剂），向未处理的孔中加入相同体积的DMSO。寡霉素储备液在DMSO中重悬10mM。将板放回组织培养箱中2天。 培养基变化以评估增殖的复合物I活性注意：在无丙酮酸培养基中增殖的细胞更依赖于复合物I活性11，12。在没有丙酮酸的情况下，培养的细胞需要复合物I以促进大部分NADH再氧化回NAD + （图2）。复合物I抑制剂鱼藤酮用作对照。制作补充有 10% FBS 和 1% 青霉素链霉素的不含丙酮酸的 DMEM 培养基。 制作1M丙酮酸溶液（见 表1）。 将每个孔中的培养基更换为不含丙酮酸的培养基或含丙酮酸的培养基。向处理过的孔中加入2μM鱼藤酮（复合物I抑制剂），向未处理的孔中加入相同体积的DMSO。鱼藤酮储备液在DMSO中重悬25mM。将板放回组织培养箱中2天。 通过增殖评估DHODH活性的培养基变化注意：在无尿苷培养基中增殖的细胞需要二氢乳清酸脱氢酶（DHODH）活性11，12，13。在没有外源性尿苷的情况下，培养的细胞通过从头途径合成嘧啶。DHODH抑制剂brequinar用作对照。制作补充有 10% FBS 和 1% 青霉素-链霉素的不含尿苷的 DMEM。 制备10 mg/mL尿苷储备溶液，然后制备100 μg/mL尿苷培养基（见 表1）。 将每个孔中的培养基更换为无尿苷培养基或含尿苷培养基。向处理过的孔中加入5μM的Brequinar（DHODH抑制剂），向未处理的孔中加入相同体积的DMSO。将苞片原液重悬于DMSO中10 mM。将板放回组织培养箱中2天。 计数用于增殖测定的细胞对于所有实验，每2天补充一次培养基。如果介质变黄，请增加介质更换的频率。让细胞增殖长达7天，如果任何孔开始看起来杂草丛生，则停止实验。当汇合度超过80%时，井被认为是杂草丛生的。 吸出培养基，用 1x PBS 洗涤，并用 0.25% 胰蛋白酶（6 孔培养皿为 500 μL）覆盖孔底部。 等待5分钟，直到细胞从培养皿上抬起。在显微镜下检查。 用 1 mL 含有 10% FBS 的完整 DMEM 淬灭胰蛋白酶。 上下移液以分解细胞团块。 准备库尔特柜台杯，在每个杯中填充 10 mL 等酮缓冲液（每孔一杯）。对细胞计数器上的细胞进行计数，并记录数据。如果读数是每毫升细胞数（细胞/mL），则将记录的值乘以1.5，得到每孔的细胞总数。注意：如果实验室没有库尔特计数器，其他细胞计数方法（如血细胞计数器）就足够了。 2. 13C4-天冬氨酸稳定同位素示踪和LC-MS分析以测量DHODH活性 13贴壁细胞中的C4-天冬氨酸稳定同位素示踪注意：可以通过测量 13C4-天冬氨酸掺入 13C 3-UMP 来直接监测 DHODH 活性。Brequinar用作DHODH活性的对照（图3）。由此产生的13C3-UMP水平是DHODH活性的量度。在 6 孔培养皿中接种 250，000 到 500，000 个细胞，第二天达到 75% 的汇合度。 制备250mM 13 C 4-天冬氨酸和10 mM 13C4-天冬氨酸培养基的储备溶液（见表1）。 将每个孔中的培养基更换为含有10mM 13C4-天冬氨酸的培养基。孵育适当的小时数以达到标记目标细胞的稳定状态。注意：稳定状态定义为百分比标记的代谢物随时间14稳定的时间范围。对于143B骨肉瘤细胞，13C4-天冬氨酸在8小时内达到稳定状态。最佳做法是在实验之前通过对感兴趣的稳定同位素进行时程实验来确定此时间范围。 从贴壁细胞中分离代谢物在开始之前，准备一桶干冰，并在HPLC级水中制备80%HPLC级MeOH。将该缓冲液在-80°C冰箱中冷却过夜或直接放在干冰上。 一次从培养箱中取出一个板，从孔中吸出培养基，并用1x PBS洗涤2次。在继续下一步之前，从孔中取出所有残留的PBS。注意：确保在吸液过程中倾斜板并将移液器靠在培养皿壁上，以防止贴壁细胞的破坏。 将板放在干冰上，并立即向每个孔中加入 800 μL 80% LCMS 级 MeOH 和 20% LCMS 级水。 将板在-80°C冰箱中孵育至少15分钟以促进细胞裂解。注意：此时，可以将下一个板从培养箱中取出并重复步骤2.2.1-2.2.4。继续此操作，直到所有板在-80°C冰箱中孵育。 一次从冰箱中取出一个板，使用细胞提升器在干冰上刮每个孔，并将裂解物转移到 1.5 mL 微量离心管中。将管子放在干冰上，直到下一步。 在4°C下涡旋所有管10分钟，然后在4°C下以最大速度（至少17，000× g）离心10分钟。 将上清液转移到1.5mL微量离心管中，并在配备有-105°C冷阱的4°C真空浓缩器中在高真空设置下干燥约6小时或直到样品蒸发。裂解物干燥后，将代谢物沉淀储存在-80°C，直到准备好准备液相色谱与质谱（LCMS）配对。 极性代谢物的液相色谱-质谱（LC-MS）测量注意：任何允许检测天冬氨酸、 从头 嘧啶生物合成中的中间体和UMP的色谱和质谱工作流程就足够了14。通过在干燥的沉淀中加入 100 μL HPLC 级水并在 4 °C 下涡旋 10 分钟，在冰上制备 LCMS 样品。 将样品在4°C下以最大速度（至少17，000 × g）离心10分钟，并将25μL移动到每个LC-MS小瓶中。 将 2 μL 裂解物注入 LC-MS 系统。下面给出了一种常用的方法：制备含有溶解在LC-MS级水中的20 mM碳酸铵（LC-MS级）和0.1%氢氧化铵（LC-MS级）的 流动相A 。 选择100%乙腈（LC-MS级）作为 流动相B。 对于色谱，选择5 μm、150 mm x 2.1 mm分析柱，配备2.1 mm x 20 mm亲水化合物保护柱（参见 材料表）。将柱炉设置为25°C。 使用以下液相色谱设置：恒定流速为 0.15 mL/min;80%至20%流动相B的线性梯度持续20分钟，然后以20%至80%流动相B的线性梯度保持0.5分钟，然后在80%流动相B下保持7.5分钟。 选择以下质谱仪设置：m/z 70 Da和1，000 Da之间的全扫描;分辨率为70，000;AGC目标为1×106;最长注入时间为 20 毫秒。在极性开关模式下操作电源。将喷雾电压设置为3.0 kV，加热毛细管设置为275°C，HESI探头设置为350°C，护套气流设置为40个单位，辅助气流设置为15个单位，扫描气流设置为1个单位。 使用与LCMS工作流程接口的任何软件执行数据分析。注意：与上述工作流程一起使用的软件是XCalibur（Thermo）和TraceFinder（Thermo）。数据分析的关键考虑因素概述如下：预期保留时间： 通过在实验前使用色谱方法运行每种目标代谢物的标准品来确定每种代谢物的保留时间。注意：UMP及其同位素异构体（包括13C 3-UMP）的保留时间完全相同。 代谢物的预期 M/Z：如果代谢物在负离子模式（例如UMP）下电离，则使用UMP减去质子的分子式[C 9 H14N2O9P]计算预期的精确质量数。对于以正离子模式电离的代谢物，使用分子式加质子计算确切的质量。 质量精度： 当使用轨道质谱仪时，目标代谢物及其同位素体预计具有±5 mmu的质量精度。使用软件进行计算，考虑预期的 M/Z 和实际检测到的 M/Z。 自然丰度校正：预计所有示踪数据都将经过自然丰度校正，以解释自然界中的~1C和~0.5 N-同位素15。 3. 13C5-谷氨酰胺稳定同位素示踪测量SDH活性 13贴壁细胞中的C5-谷氨酰胺稳定同位素示踪注意：SDH活性可以通过测量富马酸盐和琥珀酸盐的某些同位素在13C5-谷氨酰胺示踪7，16，17上的相互转化来直接监测。复合物III抑制剂抗霉素用作改变SDH复合物净方向性的对照（图4）。在 6 孔培养皿中接种 250，000 到 500，000 个细胞，第二天达到 75% 的汇合度。 准备50 mM 13C5-谷氨酰胺的储备液（见 表1）。 制备含有2 mM 13C5-谷氨酰胺的示踪培养基（见 表1）。 将每个孔中的培养基更换为含有2 mM 13C5-谷氨酰胺的培养基。孵育适当的小时数以达到标记目标细胞的稳定状态（参见步骤2.1.3中的注释）。 按照步骤2.2中的方案分离代谢物。 按照步骤2.3中所述的工作流程分析LC-MS上的样品。 基于标记模式分析 SDH 活性注意：SDH复合物的琥珀酸氧化活性可以通过评估13C 4-富马酸盐与13 C4-琥珀酸酯在13C5-谷氨酰胺示踪时的比率来监测。SDH复合物的富马酸盐还原活性可以通过评估13C 3-琥珀酸与13 C3-富马酸盐在13C5-谷氨酰胺示踪时的比率来监测。计算 13C 3-富马酸盐、13 C4-富马酸盐、13C3-琥珀酸和 13C4-琥珀酸的百分比标记。例如，要确定13C 3-富马酸盐的百分比，请将富马酸盐同位素体（未标记的富马酸盐、13 C1-富马酸盐、13 C 2-富马酸盐、13C3-富马酸盐和13C 4-富马酸盐）的所有积分峰面积相加，并将13C3-富马酸盐的峰面积除以总同位素体面积。乘以 100。 要计算琥珀酸氧化，请将百分比 13C 4-富马酸盐除以百分比 13C4-琥珀酸。 要计算富马酸盐减少量，请将百分比 13C 3-琥珀酸除以百分比 13C3-富马酸盐。 4. 直接复合物I活性测定 注意：DCPIP是一种人造电子受体;当接受来自泛醇的电子时，它会变成还原形式。在该测定中，泛醌通过复杂的I介导的NADH氧化为NAD +还原为泛醇。因此，在这种无细胞测定中测量氧化DCPIP的周转是复合物I活性7，18的代表。 从细胞中纯化和量化线粒体注意：任何线粒体纯化方案都可用于本测定19。扩增细胞，直到获得25-1亿个细胞。从培养皿中吸出培养基，用1x PBS洗涤，吸出PBS，并用0.25%胰蛋白酶尝试旋转细胞。用培养基淬灭胰蛋白酶，并以1，000× g 沉淀细胞5分钟。 在 5 mL 的 1x PBS 中洗涤细胞沉淀 2 次，并以 1，000 × g 重复离心 5 分钟以沉淀细胞。将洗涤的沉淀储存在-20°C冰箱中，直到线粒体纯化。注意：不要多次冷冻解冻细胞沉淀。 制备线粒体分离缓冲液（见 表1）。注意：含钠试剂（如NaOH）不应用于制备线粒体分离缓冲液，因为钠会失去线粒体膜电位20 并破坏线粒体钙稳态21。 将细胞沉淀重悬至每 1 mL 线粒体分离缓冲液 1000 万个细胞。例如，将 1 亿个沉淀细胞重悬于 10 mL 线粒体分离缓冲液中。注意：确保破坏细胞团块，而不会将气泡引入缓冲液中。 将 2 mL 细胞悬液移至工作体积为 3-8 mL 的预冷玻璃均质器中，该均质器与 Potter-Elvehjem PTFE 杵兼容。用10-20次冲程匀浆细胞，在显微镜下监测细胞以确认整个匀浆过程中的细胞裂解。如果需要，增加中风次数以确保有效的细胞裂解。注意：如果用上述方法均质细胞对裂解细胞无效，请切换到注射器裂解方法22。 将2mL细胞裂解物转移到冰上的微量离心管中，并重复上述步骤，直到整个细胞悬液均质化。 在4°C离心机中以650× g 沉淀细胞核和细胞碎片10分钟。 将上清液移至新的2.0mL管中，并在4°C下以650× g 重复上述离心10分钟。 将上清液移至新的2.0mL管中，并在4°C离心机中以7，000× g 沉淀粗线粒体10分钟。 弃去上清液，并将沉淀重悬于1mL线粒体分离缓冲液中。将 50 μL 移入新试管中进行蛋白质定量。对样品的两个等分试样（50 μL 样品和剩余的 ~950 μL）重复上述离心步骤。 弃去上清液，并将沉淀储存在-80°C冰箱中直至准备使用。 从 50 μL 等分试样向沉淀中加入 200 μL RIPA 缓冲液以提取蛋白质，涡旋 10 分钟，并以 21，000 × g 离心以分离蛋白质。定量 50 μL 等分试样中的蛋白质量，并使用该数字定量 950 μL 样品中的剩余蛋白质。例如，如果 50 μL 等分试样的蛋白质定量为 1 μg/μL，则剩余线粒体沉淀中的总蛋白质为 950 μg（1 μg/μL × 950 μL）。 进行复合物I活性测定注意：143B骨肉瘤细胞系用于此测定，但该方案可以适用于任何培养的细胞。将纯化的线粒体重悬于线粒体重悬缓冲液中（见 表1），终浓度为5mg蛋白质/ mL。 在-20°C冰箱中进行五个冻融循环以透化线粒体。 制作复杂的I活性测定缓冲液（见 表1）。 将 50 ug 的 5 mg/mL 线粒体原液与 90 μL 复合物 I 活性缓冲液混合。准备五个未处理的重复和五个鱼藤酮处理的（5μM）重复以控制复合物I活性。 在设置为37°C的读板器中读取600nm处的基线吸光度。 通过将NADH加入至终浓度为2mM来启动反应，并在1小时内跟踪吸光度（600nm），在整个过程中至少每2分钟测量一次。吸光度的降低表明DCPIP通过复合物I活性降低。注意：应使用多通道移液器添加NADH，以确保同时启动所有样品。 5. 基于LC-MS的测定法，用于测量超氧化物水平 注意：MitoSox Red的荧光特性可以独立于其与超氧化物23的反应而变化。这种基于 LC-MS 的测定直接测量与 MitoSox Red 反应的超氧化物产物。以下测定法略有修改自Xiao等人24。2-羟基-丝分裂乙鎓（2-OH MitoE2+）是超氧化物反应的产物（图5）。Caki1细胞系用于该测定，但该方案可以适用于任何培养的细胞。 用丝裂索红处理贴壁细胞在 6 孔培养皿中接种 250，000 到 500，000 个细胞，第二天达到 75% 的汇合度。确保接种一组用于LC-MS测定的板和一组用于细胞计数标准化的重复板。 在Dulbecco的改良Eagle培养基中制备含有10%热灭活FBS和1%青霉素链霉素的完整DMEM。 用 2 mL 完整的 DMEM 刷新所有孔中所有条件下的培养基。确保在这一点上添加任何感兴趣的药物或治疗方法。 将细胞在组织培养箱中孵育1小时。 准备阳性和阴性对照。制备在PBS中稀释的50 mM叔丁基过氧化氢储备液和在DMSO中稀释的250 mMN-乙酰半胱氨酸（NAC）储备液（见 表1）。注意：叔丁基过氧化氢（tBuOOH）是一种有效的活性氧，可作为阳性对照并增加2-OH MitoE2+的量。NAC是一种有效的抗氧化剂，可作为阴性对照并中和由tBuOOH引起的超氧化物产生。 向阳性对照孔中加入 1 μL tBuOOH，向阴性对照孔中加入 1 μL tBuOOH + 100 μL NAC。注意：使用 P2 移液器（0.1-2 μL 范围）是转移 1 μL 的最佳方法。 在组织培养箱中孵育1小时。 准备 1 mM 丝裂索红储备液（见表 1），并向每个孔中加入 2 μL 1 mM 丝裂索红，以达到 1 μM 的终浓度。 在组织培养箱中孵育30分钟。 在最终孵育期间，对其中一个重复板进行计数以获取细胞计数，以归一化最终LC-MS数据。 从贴壁细胞中分离氧化的丝裂红产物取一桶干冰，在开始分离之前将凉爽的HPLC级异丙醇放在干冰上。 一次取出一个板，从孔中吸出培养基，并用 1 mL 的 1x PBS 洗涤 2 次。从孔中吸出所有残留的PBS，然后再进行下一步。注意：确保在吸液过程中倾斜板并将移液器靠在培养皿壁上，以防止贴壁细胞的破坏。 将板放在干冰上，并向每个孔中加入 800 μL HPLC 级异丙醇。 将板在-80°C冰箱中孵育至少15分钟以促进细胞裂解。注意：此时，可以将下一个板从培养箱中取出，并重复步骤5.2.1-5.2.4。继续此操作，直到所有板在-80°C冰箱中孵育。 一次从冰箱中取出一个板，使用细胞升降器在干冰上刮除每个孔，并将裂解物转移到 1.5 mL 微量离心管中。将管子放在干冰上，直到下一步。 在4°C下涡旋所有管10分钟，然后在4°C下以最大速度（至少17，000× g）离心10分钟。 将上清液转移到 1.5 mL 微量离心管中，并在真空浓缩器中干燥。裂解物干燥后，将代谢物沉淀储存在-80°C，直到准备好进行LC-MS。 丝裂索红和 2-羟基丝分裂乙铔（2-OH MitoE2+）的 LC-MS 测量通过添加 100 μL 3：3：1 的 HPLC 级 MeOH：氯仿：水混合物，在冰上制备 LCMS 样品。在4°C下涡旋10分钟。 将 25 μL 移入每个 LC-MS 样品瓶中。将剩余的样品储存在-80°C冰箱中。 制备以下液相色谱缓冲液：i）缓冲液A：含有0.1%甲酸的HPLC级水;ii）缓冲液B：HPLC级乙腈与0.1%甲酸。 打开赛默飞世尔 XCalibur 仪器设置应用程序，开始开发该方法。 在此窗口的左侧边栏上查找两个框 – 第一个框允许色谱方法开发，第二个框允许质谱方法开发。 液相色谱方法开发：将流速设置为 0.25 mL/min，并以 20% B 开始方法，在 12 分钟内升至 95% B。在接下来的一分钟内，将缓冲液 B 降至 20% B，并在接下来的 2 分钟内保持该水平。注意：在20% B下的最后2分钟流量对于柱压回初始压力并使用适当的缓冲比平衡色谱柱至关重要。不包括此平衡步骤将导致所有后续运行样品的保留时间发生变化。 使用以下参数创建 调整文件 ：打开调谐应用，然后创建一个新的 调谐文件。 将 方法设置模块 （参见步骤5.3.9.3）中的任何重叠设置也应用于此调谐文件，包括 扫描范围、分辨率、极性、AGC目标和 最大IT。 将护套气体设置为 30，将辅助气体设置为 3，将扫掠气体设置为 3。将喷雾电压设置为 3 kV，将毛细管温度设置为 300，将 S 透镜射频电平设置为 60。 质谱方法开发：从潜在扫描的左下角列表中，将 完整MS 拖放到窗口中央。确保点击 全 MS 方块 下降后调整设置。 MS方法的总持续时间 为 13分钟。注意：LC方法比MS方法长，因为最后2分钟用于色谱柱修复，而不是代谢物定量。 在模块右侧的“方法 属性”下，确保“ 方法持续时间 ”和“ 运行时间 ”设置为 13.00 分钟。 以正模式运行此完全扫描，分辨率为 70，000，AGC 目标为 1 × 106。将最大 IT 设置为 100 毫秒，将扫描范围设置为 300 m/z 到 700 m/z。 在模块顶部的“优化文件”下，观察刚刚创建的 优化文件 是否链接到此方法。 运行 2 μL 样品进样的 MitoSox Red 检测方法。