概要

Визуализация кальция в Верхнем колликулусе мышей

Published: April 21, 2023
doi:

概要

В этом протоколе подробно описана процедура визуализации кальциевых ответов в верхнем бугорке (СК) бодрствующих мышей, включая визуализацию активности одного нейрона с помощью двухфотонной микроскопии с оставлением коры нетронутой у мышей дикого типа, а также визуализацию всей СК с помощью широкопольной микроскопии у мутантных мышей с частичной корой.

Abstract

Верхняя колликула (СК), эволюционно консервативная структура среднего мозга у всех позвоночных, является наиболее сложным зрительным центром до появления коры головного мозга. Он получает прямые входные данные от ~30 типов ганглиозных клеток сетчатки (RGC), каждый из которых кодирует определенную визуальную особенность. Остается неясным, наследует ли СК просто особенности сетчатки, или же в СК происходит дополнительная и потенциально de novo обработка. Чтобы выявить нейронное кодирование визуальной информации в СК, мы приводим здесь подробный протокол оптической регистрации зрительных реакций с помощью двух взаимодополняющих методов у бодрствующих мышей. Один метод использует двухфотонную микроскопию для визуализации активности кальция в разрешении одной клетки без абляции коры головного мозга, в то время как другой использует широкопольную микроскопию для визуализации всей СК мутантной мыши, кора головного мозга которой в значительной степени не развита. В этом протоколе подробно описаны эти два метода, включая подготовку животных, инъекцию вируса, имплантацию головной пластины, имплантацию пробки, сбор данных и анализ данных. Репрезентативные результаты показывают, что двухфотонная кальциевая визуализация выявляет визуально вызванные нейронные реакции при разрешении одной клетки, а широкопольная кальциевая визуализация показывает нейронную активность во всем СК. Комбинируя эти два метода, можно выявить нейронное кодирование в СК в разных масштабах, и такая комбинация может быть применена и к другим областям мозга.

Introduction

Верхний бугорок (СК) является важным зрительным центром у всех позвоночных. У млекопитающих он получает прямые входные сигналы от сетчатки и зрительной коры1. В то время как оптическая регистрация широко применяется в кореголовного мозга 2,3,4,5, ее применение в СК затруднено плохими оптическими доступами 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 ,18,19. Целью данного протокола является предоставление подробной информации о двух взаимодополняющих методах оптической регистрации нейронной активности в СК.

СК располагается под корой головного мозга и поперечным синусом, что ограничивает оптический доступ к колликулярным нейронам. Один из подходов к преодолению этого ограничения заключается в аспирации коры головного мозга и обнажении передне-бокового SC 7,9,10,13,14,19. Однако, поскольку СК получает входные данные коры головного мозга, такая операция может повлиять на то, как нейроны СК реагируют на визуальные стимулы. Чтобы преодолеть это ограничение, мы подробно описали здесь альтернативный протокол визуализации поверхностного слоя заднемедиальной СК с помощью кремниевой пробки, оставляя кору нетронутой 8,11. В частности, для достижения одноклеточного разрешения мы применили двухфотонную микроскопию для получения изображений кальциевых ответов в заднемедиальном СК мышей дикого типа. Кроме того, чтобы добиться широкого охвата, мы применили широкопольную микроскопию для визуализации всей СК мутантной мыши, у которой задняя кора головного мозга не развилась20.

Два метода, описанные в этом протоколе, дополняют друг друга. Двухфотонная кальциевая визуализация без абляции коры головного мозга подходит для регистрации нейронной активности с разрешением одной клетки с интактными корковыми входами. Широкопольная кальциевая визуализация подходит для регистрации нейронной активности во всей СК при этом в ущерб пространственному разрешению.

Protocol

Все экспериментальные процедуры были проведены в соответствии с рекомендациями по благополучию животных и одобрены IACUC при Китайском институте исследований мозга в Пекине. ПРИМЕЧАНИЕ: График этого протокола следующий: 1) сделать присоску; 2) ввести вирус; 3) имплантироват…

Representative Results

На рисунках 1A, B показано, как изготовить присоску и пробки соответственно. На рисунке 2 показано, как успешно имплантировать пробку. После имплантации пробки обнажается задне-медиальная СК, как показано на рисунке 2D. Н…

Discussion

Критические шаги в протоколе
Наиболее ответственным этапом является трепанация черепа на этапах 5.2 и 5.3. Во-первых, кость на 0,5 мм позади лямбды толстая и имеет кровеносные сосуды внутри, что может вызвать кровотечение в процессе сверления. Для остановки кровотечения следует ?…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Работа выполнена при поддержке Национального фонда естественных наук Китая (32271060). Ю.-Т.Л. спроектировал исследование, провел эксперимент, проанализировал данные и написал рукопись. З.Л. и Р.В. проводили эксперимент.

Materials

16x objective Nikon
50-mm lens Computar M5018-MP2
5-mm coverslip Warner instruments CS-5R
bandpass filter Chroma Technology HQ575/250 m-2p
butyl cyanoacrylate Vetbond, World Precision Instruments
camera for monitoring pupil FLIR BFS-U3-04S2M-CS
camera for widefield imaging Basler acA2000-165µm
corona treater Electro-Technic Products BD-20AC
dichroic Chroma Technology T600/200dcrb 
galvanometers Cambridge Technology
glass bead sterilizer RWD RS1502
microdrill RWD 78001
micromanipulator Sutter Instruments QUAD
photomultiplier tube Hamamatsu R3896
rotory encoder USdigital MA3-A10-125-N
self-curing dental adhesive resin cement  SuperBond C&B, Sun Medical Co, Ltd. Moriyama, Japan
thermostatic heating pad  RWD 69020
Ti:Sapphire laser Spectra-Physics Mai Tai HP DeepSee
translucent silicone adhesive  Kwik-Sil, World Precision Instruments
treadmill Xinglin Biology
Virus Strains
rAAV2/9-hsyn-Gcamp6m Vector Core at Chinese Institute for Brain Research, Beijing
Animals
C57BL/6J wild type Laboratory Animal Resource Center at Chinese Institute for Brain Research, Beijing
Emx1-Cre The Jackson Laboratory  5628
Pals1flox/wt Christopher A. Walsh Lab
Software
ImageJ NIH Image
Labview National Instruments
MATLAB Mathworks

参考文献

  1. May, P. J. The mammalian superior colliculus: laminar structure and connections. Progress in Brain Research. 151, 321-378 (2006).
  2. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  3. Ohki, K., Chung, S., Ch’ng, Y. H., Kara, P., Reid, R. C. Functional imaging with cellular resolution reveals precise micro-architecture in visual cortex. Nature. 433 (7026), 597-603 (2005).
  4. Ratzlaff, E. H., Grinvald, A. A tandem-lens epifluorescence macroscope: Hundred-fold brightness advantage for wide-field imaging. Journal of Neuroscience Methods. 36 (2-3), 127-137 (1991).
  5. de Vries, S. E. J., et al. A large-scale standardized physiological survey reveals functional organization of the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 23 (1), 138-151 (2020).
  6. Mrsic-Flogel, T. D., et al. Altered map of visual space in the superior colliculus of mice lacking early retinal waves. The Journal of Neuroscience. 25 (29), 6921-6928 (2005).
  7. Cang, J., Wang, L., Stryker, M. P., Feldheim, D. A. Roles of ephrin-as and structured activity in the development of functional maps in the superior colliculus. The Journal of Neuroscience. 28 (43), 11015-11023 (2008).
  8. Feinberg, E. H., Meister, M. Orientation columns in the mouse superior colliculus. Nature. 519 (7542), 229-232 (2015).
  9. Ahmadlou, M., Heimel, J. A. Preference for concentric orientations in the mouse superior colliculus. Nature Communications. 6, 6773 (2015).
  10. de Malmazet, D., Kühn, N. K., Farrow, K. Retinotopic separation of nasal and temporal motion selectivity in the mouse superior colliculus. Current Biology. 28 (18), 2961-2969 (2018).
  11. Li, Y. T., Turan, Z., Meister, M. Functional architecture of motion direction in the mouse superior colliculus. Current Biology. 30 (17), 3304-3315 (2020).
  12. Gribizis, A., et al. Visual cortex gains independence from peripheral drive before eye opening. Neuron. 104 (4), 711-723 (2019).
  13. Inayat, S., et al. Neurons in the most superficial lamina of the mouse superior colliculus are highly selective for stimulus direction. The Journal of Neuroscience. 35 (20), 7992-8003 (2015).
  14. Barchini, J., Shi, X., Chen, H., Cang, J. Bidirectional encoding of motion contrast in the mouse superior colliculus. eLife. 7, 35261 (2018).
  15. Savier, E. L., Chen, H., Cang, J. Effects of locomotion on visual responses in the mouse superior colliculus. The Journal of Neuroscience. 39 (47), 9360-9368 (2019).
  16. Schröder, S., et al. Arousal modulates retinal output. Neuron. 107 (3), 487-495 (2020).
  17. Ge, X., et al. Retinal waves prime visual motion detection by simulating future optic flow. Science. 373 (6553), (2021).
  18. Chen, H., Savier, E. L., DePiero, V. J., Cang, J. Lack of evidence for stereotypical direction columns in the mouse superior colliculus. The Journal of Neuroscience. 41 (3), 461-473 (2021).
  19. Kasai, M., Isa, T. Effects of light isoflurane anesthesia on organization of direction and orientation selectivity in the superficial layer of the mouse superior colliculus. The Journal of Neuroscience. 42 (4), 619-630 (2022).
  20. Kim, S., et al. The apical complex couples cell fate and cell survival to cerebral cortical development. Neuron. 66 (1), 69-84 (2010).
  21. Kaifosh, P., Zaremba, J. D., Danielson, N. B., Losonczy, A. S. I. M. A. Python software for analysis of dynamic fluorescence imaging data. Frontiers in Neuroinformatics. 8, 80 (2014).
  22. Pnevmatikakis, E. A., Giovannucci, A. NoRMCorre: An online algorithm for piecewise rigid motion correction of calcium imaging data. Journal of Neuroscience Methods. 291, 83-94 (2017).
  23. Kerlin, A. M., Andermann, M. L., Berezovskii, V. K., Reid, R. C. Broadly tuned response properties of diverse inhibitory neuron subtypes in mouse visual cortex. Neuron. 67 (5), 858-871 (2010).
  24. Göbel, W., Helmchen, F. In vivo calcium imaging of neural network function. Physiology. 22 (6), 358-365 (2007).
  25. Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
  26. Evans, D. A., et al. A synaptic threshold mechanism for computing escape decisions. Nature. 558 (7711), 590-594 (2018).

Play Video

記事を引用
Li, Z., Wu, R., Li, Y. Calcium Imaging in Mouse Superior Colliculus. J. Vis. Exp. (194), e65181, doi:10.3791/65181 (2023).

View Video