Calciumbeeldvorming bij superieure colliculus bij muizen
概要
Dit protocol beschrijft de procedure voor het in beeld brengen van calciumresponsen in de superieure colliculus (SC) van wakkere muizen, inclusief het in beeld brengen van de activiteit van één neuron met twee fotonen met behulp van twee-fotonmicroscopie terwijl de cortex intact blijft bij wild-type muizen, en het in beeld brengen van de gehele SC met breedveldmicroscopie bij mutante muizen met gedeeltelijke cortex.
Abstract
De superieure colliculus (SC), een evolutionair geconserveerde middenhersenstructuur bij alle gewervelde dieren, is het meest geavanceerde visuele centrum vóór het ontstaan van de hersenschors. Het ontvangt directe input van ~30 soorten retinale ganglioncellen (RGC’s), die elk coderen voor een specifiek visueel kenmerk. Het blijft ongrijpbaar of de SC gewoon retinale kenmerken erft of dat er aanvullende en mogelijk de novo verwerking plaatsvindt in de SC. Om de neurale codering van visuele informatie in de SC te onthullen, bieden we hier een gedetailleerd protocol om visuele reacties optisch vast te leggen met twee complementaire methoden bij wakkere muizen. De ene methode maakt gebruik van twee-fotonmicroscopie om calciumactiviteit in beeld te brengen met een resolutie van één cel zonder de overlappende cortex te ablateren, terwijl de andere breedveldmicroscopie gebruikt om de hele SC van een gemuteerde muis af te beelden waarvan de cortex grotendeels onontwikkeld is. Dit protocol beschrijft deze twee methoden, waaronder diervoorbereiding, virale injectie, implantatie van de kopplaat, implantatie van pluggen, data-acquisitie en data-analyse. De representatieve resultaten tonen aan dat de calciumbeeldvorming met twee fotonen visueel opgewekte neuronale reacties onthult met een resolutie van één cel, en de calciumbeeldvorming met een breed veld onthult neurale activiteit over de hele SC. Door deze twee methoden te combineren, kan men de neurale codering in de SC op verschillende schalen onthullen, en een dergelijke combinatie kan ook worden toegepast op andere hersengebieden.
Introduction
De superieure colliculus (SC) is een belangrijk visueel centrum bij alle gewervelde dieren. Bij zoogdieren ontvangt het directe input van het netvlies en de visuele cortex1. Hoewel optische opname op grote schaal is toegepast op de cortex 2,3,4,5, wordt de toepassing ervan in de SC belemmerd door slechte optische toegangen 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 18,19. Het doel van dit protocol is om details te geven over twee complementaire methoden voor optische registratie van de neurale activiteit in de SC.
De SC bevindt zich onder de cortex en de transversale sinus, wat de optische toegang tot de colliculaire neuronen beperkt. Een benadering om deze beperking te overwinnen is om de overlappende cortex op te zuigen en de anterieure-laterale SC 7,9,10,13,14,19 bloot te leggen. Omdat de SC echter corticale input ontvangt, kan een dergelijke operatie van invloed zijn op hoe de SC-neuronen reageren op visuele stimuli. Om deze beperking te overwinnen, beschrijven we hier een alternatief protocol om de oppervlakkige laag van de posterieure-mediale SC af te beelden met een siliciumplug, terwijl de cortex intact blijft 8,11. Om een eencellige resolutie te bereiken, pasten we twee-fotonmicroscopie toe om calciumresponsen in de posterieure-mediale SC van wildtype muizen in beeld te brengen. Om een brede dekking te bereiken, pasten we bovendien breedveldmicroscopie toe om de volledige SC van een gemuteerde muis waarvan de achterste cortex zich niet heeft ontwikkeld20 in beeld te brengen.
De twee methoden die in dit protocol worden beschreven, zijn complementair aan elkaar. De calciumbeeldvorming met twee fotonen zonder de cortex te ablateren is geschikt voor het registreren van neurale activiteit met een resolutie van één cel met intacte corticale inputs. De breedveldcalciumbeeldvorming is geschikt voor het registreren van neurale activiteit in de gehele SC terwijl de ruimtelijke resolutie wordt opgeofferd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritieke stappen in het protocol
De meest kritische stap is de craniotomie in stap 5.2 en 5.3. Ten eerste is het bot op 0,5 mm achter de lambda dik en bevat het bloedvaten aan de binnenkant, die tijdens het boorproces bloedingen kunnen veroorzaken. Er moet voldoende gelschuim worden voorbereid om het bloeden te stoppen. Ten tweede is er een goede kans op angiorrhexis bij het verwijderen van het bot net boven de transversale sinus. Voor het oplossen van problemen is een alternatieve aanpak om het bot i…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk wordt ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (32271060). Y.-t.L. ontwierp het onderzoek, voerde het experiment uit, analyseerde de gegevens en schreef het manuscript. Z.L. en R.W. voerden het experiment uit.
Materials
| 16x objective | Nikon | ||
| 50-mm lens | Computar | M5018-MP2 | |
| 5-mm coverslip | Warner instruments | CS-5R | |
| bandpass filter | Chroma Technology | HQ575/250 m-2p | |
| butyl cyanoacrylate | Vetbond, World Precision Instruments | ||
| camera for monitoring pupil | FLIR | BFS-U3-04S2M-CS | |
| camera for widefield imaging | Basler | acA2000-165µm | |
| corona treater | Electro-Technic Products | BD-20AC | |
| dichroic | Chroma Technology | T600/200dcrb | |
| galvanometers | Cambridge Technology | ||
| glass bead sterilizer | RWD | RS1502 | |
| microdrill | RWD | 78001 | |
| micromanipulator | Sutter Instruments | QUAD | |
| photomultiplier tube | Hamamatsu | R3896 | |
| rotory encoder | USdigital | MA3-A10-125-N | |
| self-curing dental adhesive resin cement | SuperBond C&B, Sun Medical Co, Ltd. Moriyama, Japan | ||
| thermostatic heating pad | RWD | 69020 | |
| Ti:Sapphire laser | Spectra-Physics | Mai Tai HP DeepSee | |
| translucent silicone adhesive | Kwik-Sil, World Precision Instruments | ||
| treadmill | Xinglin Biology | ||
| Virus Strains | |||
| rAAV2/9-hsyn-Gcamp6m | Vector Core at Chinese Institute for Brain Research, Beijing | ||
| Animals | |||
| C57BL/6J wild type | Laboratory Animal Resource Center at Chinese Institute for Brain Research, Beijing | ||
| Emx1-Cre | The Jackson Laboratory | 5628 | |
| Pals1flox/wt | Christopher A. Walsh Lab | ||
| Software | |||
| ImageJ | NIH Image | ||
| Labview | National Instruments | ||
| MATLAB | Mathworks |
参考文献
- May, P. J. The mammalian superior colliculus: laminar structure and connections. Progress in Brain Research. 151, 321-378 (2006).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Ohki, K., Chung, S., Ch’ng, Y. H., Kara, P., Reid, R. C. Functional imaging with cellular resolution reveals precise micro-architecture in visual cortex. Nature. 433 (7026), 597-603 (2005).
- Ratzlaff, E. H., Grinvald, A. A tandem-lens epifluorescence macroscope: Hundred-fold brightness advantage for wide-field imaging. Journal of Neuroscience Methods. 36 (2-3), 127-137 (1991).
- de Vries, S. E. J., et al. A large-scale standardized physiological survey reveals functional organization of the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 23 (1), 138-151 (2020).
- Mrsic-Flogel, T. D., et al. Altered map of visual space in the superior colliculus of mice lacking early retinal waves. The Journal of Neuroscience. 25 (29), 6921-6928 (2005).
- Cang, J., Wang, L., Stryker, M. P., Feldheim, D. A. Roles of ephrin-as and structured activity in the development of functional maps in the superior colliculus. The Journal of Neuroscience. 28 (43), 11015-11023 (2008).
- Feinberg, E. H., Meister, M. Orientation columns in the mouse superior colliculus. Nature. 519 (7542), 229-232 (2015).
- Ahmadlou, M., Heimel, J. A. Preference for concentric orientations in the mouse superior colliculus. Nature Communications. 6, 6773 (2015).
- de Malmazet, D., Kühn, N. K., Farrow, K. Retinotopic separation of nasal and temporal motion selectivity in the mouse superior colliculus. Current Biology. 28 (18), 2961-2969 (2018).
- Li, Y. T., Turan, Z., Meister, M. Functional architecture of motion direction in the mouse superior colliculus. Current Biology. 30 (17), 3304-3315 (2020).
- Gribizis, A., et al. Visual cortex gains independence from peripheral drive before eye opening. Neuron. 104 (4), 711-723 (2019).
- Inayat, S., et al. Neurons in the most superficial lamina of the mouse superior colliculus are highly selective for stimulus direction. The Journal of Neuroscience. 35 (20), 7992-8003 (2015).
- Barchini, J., Shi, X., Chen, H., Cang, J. Bidirectional encoding of motion contrast in the mouse superior colliculus. eLife. 7, 35261 (2018).
- Savier, E. L., Chen, H., Cang, J. Effects of locomotion on visual responses in the mouse superior colliculus. The Journal of Neuroscience. 39 (47), 9360-9368 (2019).
- Schröder, S., et al. Arousal modulates retinal output. Neuron. 107 (3), 487-495 (2020).
- Ge, X., et al. Retinal waves prime visual motion detection by simulating future optic flow. Science. 373 (6553), (2021).
- Chen, H., Savier, E. L., DePiero, V. J., Cang, J. Lack of evidence for stereotypical direction columns in the mouse superior colliculus. The Journal of Neuroscience. 41 (3), 461-473 (2021).
- Kasai, M., Isa, T. Effects of light isoflurane anesthesia on organization of direction and orientation selectivity in the superficial layer of the mouse superior colliculus. The Journal of Neuroscience. 42 (4), 619-630 (2022).
- Kim, S., et al. The apical complex couples cell fate and cell survival to cerebral cortical development. Neuron. 66 (1), 69-84 (2010).
- Kaifosh, P., Zaremba, J. D., Danielson, N. B., Losonczy, A. S. I. M. A. Python software for analysis of dynamic fluorescence imaging data. Frontiers in Neuroinformatics. 8, 80 (2014).
- Pnevmatikakis, E. A., Giovannucci, A. NoRMCorre: An online algorithm for piecewise rigid motion correction of calcium imaging data. Journal of Neuroscience Methods. 291, 83-94 (2017).
- Kerlin, A. M., Andermann, M. L., Berezovskii, V. K., Reid, R. C. Broadly tuned response properties of diverse inhibitory neuron subtypes in mouse visual cortex. Neuron. 67 (5), 858-871 (2010).
- Göbel, W., Helmchen, F. In vivo calcium imaging of neural network function. Physiology. 22 (6), 358-365 (2007).
- Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
- Evans, D. A., et al. A synaptic threshold mechanism for computing escape decisions. Nature. 558 (7711), 590-594 (2018).
