Formulação e caracterização de agentes bioativos contendo nanodiscos

As lipoproteínas discoidais nascentes de alta densidade (HDLs) são progenitores naturais da HDL esférica muito mais abundante presente no sistema circulatório humano. Essas partículas nascentes, também chamadas de HDL pré-ß, possuem propriedades estruturais únicas e distintas¹. De fato, em vez de existir como uma partícula esferoidal, as HDLs nascentes são em forma de disco. Extensos estudos de caracterização estrutural das HDLs discoidais naturais e reconstituídas têm revelado que elas são compostas por uma bicamada fosfolipídica cujo perímetro é circunscrito por uma apolipoproteína anfipática trocável (apo), como a apoA-I. No metabolismo das lipoproteínas humanas, as HDLs nascentes circulantes acumulam lipídios das células periféricas e amadurecem em HDLs esféricas em um processo que é dependente de mediadores proteicos chave, incluindo o transportador de de ligação de ATP A1 e lecitina:colesterol aciltransferse². Esse processo representa um componente crítico da via de transporte reverso do colesterol, considerada protetora contra doenças cardíacas. Munidos desse conhecimento e da capacidade de reconstituir HDLs discoidais, pesquisadores têm empregado essas partículas como intervenção terapêutica no tratamento da aterosclerose3. Em essência, a infusão de HDL reconstituído (rHDL) em pacientes promove o efluxo de colesterol dos depósitos de placa e o devolve ao fígado para conversão em ácidos biliares e excreção do corpo. Várias empresas biotecnológicas/farmacêuticas estão adotando essa estratégia de tratamento⁴.

Ao mesmo tempo, a capacidade de gerar essas partículas em laboratório desencadeou uma enxurrada de atividades de pesquisa que levaram a novas aplicações e novas tecnologias. Uma aplicação proeminente envolve o uso de partículas de rHDL como membrana em miniatura para abrigar proteínas transmembrana em um ambiente nativo⁵. Até o momento, centenas de proteínas foram incorporadas com sucesso no rHDL discoidal, e a pesquisa demonstrou que essas proteínas retêm tanto a conformação nativa quanto a atividade biológica como receptores, enzimas, transportadores, etc. Essas partículas, denominadas “nanodiscos”, também têm se mostrado passíveis de caracterização estrutural, muitas vezes em alta resolução⁶. Essa abordagem para investigações de proteínas transmembrana é reconhecida como superior aos estudos com micelas ou lipossomas em detergente e, como resultado, está avançando rapidamente. É importante reconhecer que dois métodos distintos têm sido relatados que são capazes de formar uma rHDL. O método de “diálise por colato”¹³ é popular para aplicações relacionadas à incorporação de proteínas transmembrana na bicamada rHDL⁵. Essencialmente, este método de formulação envolve a mistura de uma bicamada formando fosfolipídio, uma proteína de andaime e a proteína transmembrana de interesse em um tampão contendo o detergente colato de sódio (ou desoxicolato de sódio; peso molecular da micela [PM] de 4.200 Da). O detergente solubiliza eficazmente os diferentes componentes da reação, permitindo que a amostra seja dialisada contra tampão sem detergente. Durante a etapa de diálise, à medida que o detergente é retirado da amostra, forma-se espontaneamente um HDLr. Quando essa abordagem é usada para aprisionar uma proteína transmembrana de interesse, as partículas do produto têm sido denominadas nanodiscos⁵. Tentativas de usar esse método para incorporar agentes bioativos hidrofóbicos de pequenas moléculas (MW <1.000 Da), no entanto, têm sido em grande parte malsucedidas. Ao contrário das proteínas transmembrana, os agentes bioativos de pequenas moléculas são capazes de escapar da bolsa de diálise junto com o detergente, diminuindo consideravelmente sua eficiência de incorporação nas rHDLs. Esse problema foi resolvido com a omissão de detergentes da mistura da formulação¹⁴. Em vez disso, os componentes são adicionados a um tampão aquoso sequencialmente, começando com a bicamada formando lipídio, formando um agente bioativo estável contendo rHDL, referido como um nanodisco. Outros utilizaram a rHDL para incorporação e transporte de imagiologia in vivo ⁷. Mais recentemente, a rHDL especializada composta por um arcabouço apolipoprotéico e o glicerofosfolipídeo aniônico, cardiolipina, tem sido empregada em estudos de ligação de ligantes. Essas partículas fornecem uma plataforma para estudos da interação da cardiolipina com vários ligantes solúveis em água, incluindo cálcio, citocromo c e o agente anticâncer doxorrubicina⁸.

O foco do presente estudo está na formulação de rHDL que possuam um agente bioativo hidrofóbico incorporado de forma estável (i.e. nanodisco). A capacidade desses agentes de se integrarem ao meio lipídico das partículas de rHDL discoidal lhes confere solubilidade aquosa. Como tal, os nanodiscos têm potencial para aplicações terapêuticas in vivo . Ao formular nanodiscos, condições específicas de incubação/reação são necessárias para incorporar com sucesso agentes bioativos hidrofóbicos discretos na partícula do produto, e o objetivo deste relatório é fornecer informações práticas detalhadas que podem ser usadas como um modelo fundamental para a criação de novas partículas de nanodiscos para aplicações específicas. Assim, no contexto deste manuscrito os termos nanodisco e nanodisco não são intercambiáveis. Enquanto nanodisco refere-se a um rHDL formulado para conter uma proteína transmembrana embutida em sua bicamada lipídica⁵, o termo nanodisco refere-se a um rHDL formulado para incorporar agentes bioativos hidrofóbicos de baixo peso molecular (< 1.000 Da), como a anfotericina B¹⁴.

Uma variedade de métodos está disponível para a aquisição de proteínas adequadas do arcabouço. É possível comprar proteínas de andaimes de fabricantes [por exemplo, apoA-I (SRP4693) ou apoE4 (A3234)], no entanto, o custo pode ser um fator limitante. Uma abordagem preferida é expressar proteínas recombinantes do arcabouço em Escherichia coli. São publicados protocolos para apoA-I⁹, apoE4¹⁰ e apolipoforina-III humana e para a proteína de hemolinfa de insetos apolipoforina-III11. Para os experimentos aqui descritos, foi utilizado o domínio N-terminal (NT) humano recombinante da apoE4 (aminoácidos 1-183). A sequência de nucleotídeos que codifica apoE4-NT humana foi sintetizada e inserida em um vetor de expressão pET-22b (+) diretamente adjacente à sequência líder pelB codificada vetorialmente. Este construto leva à expressão de uma proteína de fusão da sequência líder da pelB-apoE4-NT. Após a síntese proteica, a sequência líder da pelB bacteriana direciona a proteína recém-sintetizada para o espaço periplasmático, onde a peptidase líder cliva a sequência da pelB. A proteína apoE4-NT resultante, sem tags de sequência ou caudas, posteriormente escapa da bactéria e se acumula no meio de cultura^11,12, simplificando o processamento a jusante.