ナノディスクを含む生理活性物質の製剤化とキャラクタリゼーション

新生円盤状高密度リポタンパク質(HDL)は、ヒト循環器系に存在するはるかに豊富な球状HDLの天然に存在する前駆細胞です。プレβHDLとも呼ばれるこれらの新生粒子は、独特で独特の構造特性を持っています¹。実際、新生HDLは回転楕円体粒子として存在するのではなく、円盤状です。天然および再構成された円盤状HDLに関する広範な構造特性評価研究は、それらがアポA-Iなどの両親媒性交換可能なアポリポタンパク質(apo)によって周囲が外接するリン脂質二重層で構成されていることを明らかにしました。ヒトリポタンパク質代謝では、循環新生HDLは末梢細胞から脂質を生成し、ATP結合カセットトランスポーターA1やレシチン:コレステロールアシルトランスファーゼ²などの主要なタンパク質メディエーターに依存するプロセスで球状HDLに成熟します。このプロセスは、心臓病に対して保護的であると考えられているコレステロール逆輸送経路の重要な要素を表しています。この知識と円盤状HDLを再構成する能力を武器に、研究者はこれらの粒子をアテローム性動脈硬化症を治療するための治療的介入として採用しました³。本質的に、再構成されたHDL(rHDL)を患者に注入すると、プラーク沈着物からのコレステロール流出が促進され、胆汁酸への変換と体内からの排泄のために肝臓に戻されます。いくつかのバイオテクノロジー/製薬会社がこの治療戦略を追求しています⁴。

同時に、実験室でこれらの粒子を生成する能力は、新しいアプリケーションと新しい技術につながる研究活動の急増を引き起こしました。顕著な用途の1つは、天然様環境で膜貫通タンパク質を収容するためのミニチュアメンブレンとしてのrHDL粒子の使用です⁵。現在までに、何百ものタンパク質が円盤状rHDLにうまく取り込まれており、これらのタンパク質が受容体、酵素、トランスポーターなどとして天然の立体構造と生物学的活性の両方を保持していることが研究によって実証されています。「ナノディスク」と呼ばれるこれらの粒子は、多くの場合、高解像度で構造特性評価に適していることも示されています⁶。膜貫通タンパク質の研究に対するこのアプローチは、界面活性剤ミセルやリポソームを用いた研究よりも優れていると認識されており、その結果、急速に進歩しています。rHDLを形成することができる2つの異なる方法が報告されていることを認識することが重要です。「コール酸透析」法¹³ は、rHDL二重層⁵における膜貫通タンパク質の取り込みに関連する用途に普及している。本質的に、この製剤化方法は、界面活性剤コール酸ナトリウム(またはデオキシコール酸ナトリウム;ミセル分子量[MW]4,200Da)を含む緩衝液中で、リン脂質、足場タンパク質、および目的の膜貫通タンパク質を形成する二重層を混合することを含む。界面活性剤はさまざまな反応成分を効果的に可溶化し、界面活性剤が不足しているバッファーに対してサンプルを透析することができます。透析ステップでは、サンプルから界面活性剤が除去されると、rHDLが自発的に形成されます。このアプローチを使用して目的の膜貫通タンパク質をトラップする場合、生成物粒子はナノディスク⁵と呼ばれます。しかしながら、この方法を使用して低分子疎水性生物活性剤(MW <1,000 Da)を組み込む試みは、ほとんど成功していない。膜貫通タンパク質とは異なり、低分子生理活性物質は界面活性剤とともに透析バッグから逃げることができるため、rHDLへの取り込み効率が大幅に低下します。この問題は、配合混合物¹⁴から洗剤を省略することによって解決された。代わりに、成分は水性緩衝液に順次添加され、二重層形成脂質から始まり、ナノディスクと呼ばれるrHDLを含む安定な生理活性物質を形成する。その他は、 インビボ イメージング剤⁷の取り込みおよび輸送のためにrHDLを使用している。最近では、アポリポタンパク質足場とアニオン性グリセロリン脂質であるカルジオリピンからなる特殊なrHDLがリガンド結合研究に採用されています。これらの粒子は、カルジオリピンとカルシウム、シトクロムc、および抗癌剤ドキソルビシン⁸を含む様々な水溶性リガンドとの相互作用の研究のためのプラットフォームを提供する。

本研究の焦点は、安定に組み込まれた疎水性生理活性物質(すなわちナノディスク)を有するrHDLの製剤化にある。これらの薬剤が円盤状rHDL粒子の脂質環境に統合する能力は、それらに水溶性を効果的に付与します。このように、ナノディスクは in vivo 治療用途の可能性を秘めています。ナノディスクを製剤化する場合、個別の疎水性生物活性物質を生成物粒子にうまく取り込むためには、特定のインキュベーション/反応条件が必要であり、このレポートの目的は、特定のアプリケーションのための新規ナノディスク粒子を作成するための基礎テンプレートとして使用できる詳細な実用的な情報を提供することです。したがって、この原稿の文脈では、ナノディスクとナノディスクという用語は交換可能ではありません。ナノディスクは、その脂質二重層⁵に埋め込まれた膜貫通タンパク質を含むように処方されたrHDLを指すのに対し、ナノディスクという用語は、アムホテリシン^B14などの低分子量(<1,000Da)疎水性生物活性剤を組み込むように処方されたrHDLを指す。

適切な足場タンパク質の獲得には、さまざまな方法が利用可能です。足場タンパク質をメーカー(apoA-I(SRP4693)やapoE4(A3234)など)から購入することは可能ですが、コストが制限要因となる場合があります。好ましいアプローチは、組換え足場タンパク質を大腸菌で発現させることである。ヒトapoA-I⁹、apoE4¹⁰、ならびに昆虫血リンパタンパク質アポリポフォリン-III¹¹についてのプロトコルが公開されている。本明細書に記載の実験の目的のために、組換えヒトapoE4N末端(NT)ドメイン(アミノ酸1〜183)を使用した。ヒトapoE4-NTをコードする塩基配列を合成し、ベクターコードされたpelBリーダー配列に直接隣接するpET-22b(+)発現ベクターに挿入した。この構築物は、pelBリーダー配列-apoE4-NT融合タンパク質の発現をもたらす。タンパク質合成に続いて、細菌のpelBリーダー配列は、新しく合成されたタンパク質をペリプラズム空間に誘導し、そこでリーダーペプチダーゼがpelB配列を切断します。得られたapoE4-NTタンパク質は、配列タグや尾部を持たず、その後細菌を逃がして培養培地^11,12に蓄積し、下流の処理を簡素化します。